PCR实验室知识及新冠检测生物安全培训考试(试题与答案)

PCR实验室知识及新冠检测生物安全培训考试(试题与答案)一、单项选择题（每题1分，共30分。每题只有一个正确答案，请将正确选项字母填入括号内）1.依据《新型冠状病毒临床实验室检测生物安全指南（第二版）》，新冠病毒核酸检测标本灭活首选方法是（）A.56℃30min水浴B.75%乙醇浸泡10minC.紫外线照射30minD.121℃15min高压蒸汽灭菌答案：A2.在PCR扩增曲线中，Ct值与模板初始拷贝数的关系是（）A.Ct值越大，初始拷贝数越多B.Ct值与拷贝数无关C.Ct值越小，初始拷贝数越多D.Ct值与扩增效率呈线性负相关答案：C3.下列哪项不是实时荧光PCR引物设计的基本原则（）A.避免二级结构B.3′端避免连续G/CC.产物长度50–150bpD.引物Tm值相差≥10℃答案：D4.关于生物安全柜（BSC-ⅡA2型）气流特点，正确的是（）A.70%循环，30%外排，柜内正压B.30%循环，70%外排，柜内负压C.100%外排，无循环D.100%循环，无外排答案：B5.新冠核酸检测中，内标基因选择人类RNaseP的主要目的是（）A.监测逆转录效率B.监测标本采集、提取及扩增全过程C.监测引物二聚体D.监测试剂批间差答案：B6.以下哪项操作可导致PCR假阳性（）A.提取空白对照出现阳性信号B.扩增产物开盖分析后未清理工作台面C.标本灭活不完全D.以上均是答案：D7.依据WS/T641-2018，临床PCR实验室各区域气压应满足（）A.标本接收>核酸提取>扩增>产物分析B.标本接收<核酸提取<扩增<产物分析C.标本接收<核酸提取>扩增<产物分析D.各区域等压答案：B8.使用含胍盐裂解液提取RNA时，加入无水乙醇的主要作用是（）A.沉淀蛋白质B.沉淀RNAC.抑制RNaseD.溶解脂质答案：B9.新冠病毒ORF1ab与N基因双靶标检测，若ORF1abCt=38.5、N基因Ct=22.8，判定为（）A.阳性B.阴性C.可疑，需复检D.无效答案：A10.关于脱卸个人防护装备顺序，正确的是（）A.外层手套→护目镜→防护服→内层手套→口罩B.护目镜→外层手套→防护服→口罩→内层手套C.外层手套→防护服→护目镜→口罩→内层手套D.防护服→外层手套→护目镜→口罩→内层手套答案：C11.实时荧光PCR中，FAM探针的淬灭基团常用（）A.BHQ1B.TAMRAC.ROXD.CY5答案：B12.以下哪项不是PCR抑制物（）A.肝素B.血红蛋白C.尿素D.Tris-HCl答案：D13.新冠核酸检测结果报告时限，发热门诊标本要求（）A.≤4hB.≤6hC.≤12hD.≤24h答案：B14.关于UN2814包装系统，第二层包装必须（）A.使用吸水材料B.使用金属材质C.使用透明袋D.使用可密封主容器答案：A15.以下哪项属于PCR实验室“三区两缓冲”中的“两缓冲”（）A.标本接收缓冲、产物分析缓冲B.试剂准备缓冲、核酸提取缓冲C.核酸提取缓冲、扩增缓冲D.试剂准备缓冲、产物分析缓冲答案：B16.若阳性对照Ct值较平时升高2.5，首要考虑（）A.试剂失效B.扩增仪孔位差异C.操作误差D.探针降解答案：A17.新冠病毒核酸检测标本长期保存温度（）A.4℃B.−20℃C.−70℃D.室温答案：C18.关于RNase抑制剂说法错误的是（）A.可逆性结合RNaseB.对RNaseA、B、C均有效C.终浓度一般为1U/μlD.可替代DEPC水答案：D19.以下哪项不是PCR实验室质量指标（）A.报告及时率B.假阳性率C.假阴性率D.标本采集率答案：D20.在扩增曲线平台期，荧光信号不再上升的主要原因是（）A.引物耗尽B.dNTP耗尽C.酶失活D.以上均是答案：D21.关于新冠变异株奥密克戎（B.1.1.529）对PCR检测的影响，正确的是（）A.S基因靶标全部缺失B.N基因Ct值普遍降低C.现有ORF1ab/N双靶标检测仍可有效检出D.必须改用数字PCR答案：C22.以下哪项属于BSL-2实验室必备设备（）A.生物安全柜B.动物隔离器C.正压防护服D.生命支持系统答案：A23.关于PCR防污染措施，错误的是（）A.使用dUTP+UNG系统B.扩增产物分析区安装紫外灯C.试剂准备区可处理提取后核酸D.定期用10%次氯酸擦拭工作台面答案：C24.若室内质控品呈弱阳性，连续3天同一现象，应首先（）A.更换质控品批号B.校准移液器C.更换试剂批号D.重新培训人员答案：A25.以下哪项不是新冠核酸检测“假阴性”常见原因（）A.标本采集过早B.提取效率低C.扩增仪故障D.内标基因扩增失败答案：D26.关于数字PCR优势，错误的是（）A.无需标准曲线即可绝对定量B.抗抑制能力更强C.可检测单拷贝D.通量高于荧光定量PCR答案：D27.新冠核酸检测实验室空气消毒首选（）A.0.5%过氧乙酸喷雾B.紫外线灯照射>1hC.75%乙醇喷洒D.臭氧消毒30min答案：A28.以下哪项属于“气溶胶”产生操作（）A.高速离心未配平B.移液器缓慢吸液C.标本4℃静置D.封膜机热封答案：A29.关于实验室生物危害标识，正确的是（）A.橙色背景，黑色生物符号B.红色背景，白色生物符号C.蓝色背景，白色生物符号D.黄色背景，黑色生物符号答案：D30.若标本运输箱外表面被污染，首选消毒浓度（）A.500mg/L含氯消毒液B.1000mg/L含氯消毒液C.5000mg/L含氯消毒液D.75%乙醇答案：C二、多项选择题（每题2分，共20分。每题有两个或两个以上正确答案，多选、少选、错选均不得分）31.以下哪些属于PCR实验室“单向流动”原则必须满足的要求（）A.试剂准备区→核酸提取区→扩增区B.人员流向与标本流向一致C.物品流向可逆向D.空气流向从清洁到污染答案：A、D32.可导致荧光PCR假阴性的抑制因素包括（）A.肝素钠B.血红蛋白C.滑石粉D.琼脂糖答案：A、B、C33.关于新冠病毒核酸检测标本采集，正确的是（）A.咽拭子需双侧扁桃体擦拭B.鼻咽拭子插入深度为鼻尖到耳垂距离C.采集后放入病毒保存液D.4℃保存不超过24h答案：A、B、C、D34.以下哪些属于BSL-2实验室个人防护装备（）A.医用防护口罩B.双层手套C.防水围裙D.正压呼吸器答案：A、B、C35.关于UNG酶防污染系统，正确的是（）A.识别并切割含dU的DNAB.在PCR前步骤起作用C.对RNA无影响D.可完全替代分区操作答案：A、B、C36.以下哪些情况需启动实验室污染排查（）A.阴性对照出现S型扩增B.阳性对照Ct值降低C.空白对照Ct=38D.连续3个标本同靶标Ct相同答案：A、C37.关于新冠病毒基因变异对PCR的影响，正确的是（）A.单碱基突变可能导致引物结合失败B.探针3′端突变对信号影响更大C.双靶标可显著降低漏检风险D.所有突变均导致假阴性答案：A、B、C38.以下哪些属于实验室“性能验证”指标（）A.精密度B.检出限C.线性范围D.参考区间答案：A、B、C39.关于标本溢洒处理，正确的是（）A.立即用吸水纸覆盖B.5000mg/L含氯消毒液作用30minC.从污染区向中心区倾倒消毒液D.处理完再撤离人员答案：A、B40.以下哪些属于实验室生物安全事故（）A.离心管破裂产生气溶胶B.锐器伤导致血液暴露C.防护服破损且皮肤接触标本D.紫外线灯误照5min答案：A、B、C三、填空题（每空1分，共20分）41.依据《人间传染的病原微生物名录》，新冠病毒未经培养的感染标本按危害程度分类为第____类，运输包装分类为____。答案：三；UN337342.实时荧光PCR扩增效率应在____%–____%之间，相关系数R²≥____。答案：90；110；0.9943.病毒保存液常规添加抗生素为____和____，终浓度分别为____U/ml和____μg/ml。答案：青霉素；链霉素；100；10044.依据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》，实验室应每____批次检测至少设置____份阳性质控、____份阴性质控和____份空白对照。答案：1；1；1；145.生物安全柜使用前需先开机自净____min，工作面风速应达____m/s。答案：15；0.3646.10%次氯酸钠溶液有效氯浓度约为____mg/L，稀释____倍后得1000mg/L。答案：100000；10047.新冠病毒核酸检测结果报告应使用____字体，字号不小于____号。答案：宋体；小四48.依据《临床检验定量测定项目精密度与正确度验证》，重复测定____天、每天____批次、每批次____次，方可完成精密度验证。答案：5；1；249.若标本采集后24h内无法检测，应置于____℃保存，最长不超过____天。答案：−70；750.脱卸防护装备后，应执行____步洗手法，洗手时间不少于____秒。答案：七；40四、判断题（每题1分，共10分。正确打“√”，错误打“×”）51.新冠病毒核酸检测实验室可与其他病毒检测项目共用扩增仪。（）答案：×52.生物安全柜内可明火操作，以加速干燥。（）答案：×53.实时荧光PCR的Ct值与模板初始量对数呈线性负相关。（）答案：√54.实验室出现假阳性最常见原因是标本间交叉污染。（）答案：√55.病毒保存液pH值应维持在6.8–7.4之间。（）答案：√56.扩增曲线呈“S”型但Rf值<0.9可报告阳性。（）答案：×57.实验结束后，可立即关闭生物安全柜并离开。（）答案：×58.实验室人员离岗前需进行鼻咽拭子新冠病毒核酸筛查。（）答案：√59.数字PCR可直接给出拷贝数/μl，无需标准曲线。（）答案：√60.防护服如有小面积污染，可用75%乙醇擦拭后继续使用。（）答案：×五、简答题（共30分）61.（封闭型，6分）简述实时荧光PCR出现“翘尾”曲线的三种常见原因及纠正措施。答案：（1）探针浓度过低→提高探针终浓度至200–250nM；（2）引物二聚体干扰→重新设计引物或提高退火温度2℃；（3）仪器基线设置不当→手动调整基线起始循环至2–6。62.（封闭型，6分）列举实验室发生标本溢洒导致气溶胶污染的应急处置六步法。答案：①立即停机并告知同伴；②用吸水纸覆盖溢洒区；③配制5000mg/L含氯消毒液，从外向内倾倒，作用30min；④双层收集污染物，置于生物危害袋；⑤用同浓度消毒液擦拭周边1m范围；⑥开启紫外灯>1h并填写事故记录。63.（开放型，8分）结合工作实际，分析新冠核酸检测“假阴性”五大环节并提出改进方案。答案：环节与改进：（1）采集时机——症状出现24–48h采集，避免潜伏期过早；（2）采集方法——培训采样人员，确保双侧咽+鼻咽拭子；（3）运输保存——4℃≤4h，超时−70℃；（4）提取效率——采用内标病毒样颗粒监控提取，磁珠法改为旋转柱法；（5）扩增抑制——稀释模板10倍、添加BSA至0.1μg/μl、使用UNG+dUTP系统。64.（封闭型，5分）计算：某试剂盒灵敏度验证数据为10copies/μl、20重复检出19次，求95%置信区间检出率，并判断是否合格（要求≥95%）。答案：检出率p=19/20=0.95，95%置信区间：p±1.96√[p(1−p)/n]=0.95±0.097，区间0.853–1.000；下限85.3%<95%，故暂不合格，需扩大样本量至60次。65.（开放型，5分）简述实验室如何在24h内完成从“10合1混采”到单检复核全流程，并保证质量。答案：流程：①接收混采管→扫码入库→4℃暂存；②批量灭活56℃30min；③96通道自动提取+PCR，3h出初筛；④阳性组立即拆管，原保存液−70℃取50μl单独提取；⑤单检使用快速试剂（45min扩增）；⑥结果双审核、LIS直报；⑦每批次加1份阳性质控、1份阴性质控、1份空白；⑧人员两班倒，设备24h运行，每4h校准一次移液器。六、案例分析题（共40分）66.（综合类，20分）背景：某实验室一日内出现以下结果：标本A：ORF1abCt=25.8，N基因Ct=26.0，内标Ct=28.5；标本B：ORF1abCt=38.2，N基因阴性，内标Ct=29.0；阴性对照：ORF1abCt=38.5，N基因阴性；阳性对照：ORF1abCt=19.0，N基因Ct=19.2；空白对照：无扩增。问题：（1）判定各标本结果并说明依据；（6分）（2）分析阴性对照出现信号的可能原因；（4分）（3）提出系统排查与纠正措施；（6分）（4）若需复检，写出复检方案。（4分）答案：（1）标本A：双靶标阳性，Ct<40，内标正常，报告阳性；标本B：单靶标可疑，依据指南需复检。（2）阴性对照Ct=38.5，提示低水平污染，可能为气溶胶或试剂污染。（3）排查：①更换试剂批号重做阴性对照；②提取空白、扩增空白分别放置；③紫外照射台面1h；④更换移液器滤芯；⑤人员重新培训脱卸流程。（4）复检方案：标本B原提取液复测，同时重新采样；若复测ORF1ab仍≥38且N基因阴性，则报告阴性；若Ct<38或N基因阳性，则报告阳性并送疾控测序。67.（计算+分析类，20分）实验室新引入国产试剂盒，说明书声称检出限为500copies/ml。现用WHO标准品（浓度1000IU/ml，换算系数1IU=1copy）进行验证。实验设计：将标准品用阴性鼻咽拭子保