CN118994328B 呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用 （珠海丽凡达生物技术有限公司）

合作中医药科技产业园飞蓬路30号2一种包含编码人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原的过血25.如权利要求1所述核酸分子或核酸分子混合物，其特9.一种核酸分子疫苗，其特征在于，所述核酸分子疫苗包括如所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括2050％的阳离子脂质；2050％的3[0005]RSV基因组大小约15～16kb，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白和3种非结构蛋白着经宿主细胞弗林蛋白酶(furinprotease)第1次切割，生成部分切割的融合前祖蛋白4[0007]本公开提供一种包含编码人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原的核酸分子或核酸分子[0016]在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的RR2序列选自504～524位氨基酸连[0017]在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的GS序列选自(GnS)m、(GGGGS)o、[0019]在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的的多聚化元件序列还可以选自Seq[0020]在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的的多聚化元件序列还可以选自Seq595％或98％同一性的核苷酸序列。98％同一性的核苷酸序列。加mRNA稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基6[0037]在一些实施方案中，基于提供的RNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的员将得到相应的RNA序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。在一些实施方案中，基于提供的核酸分子和/或核酸分子混合物，并将其与适配的载体复合得到能够用于临床疫苗；优选7[0045]在一些实施方案中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin_[0046]在一些实施方案中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin_8[0068]F2通常含有F0前体的第26～109位氨基酸残基；F1通常包含F0前体的第137～574[0070]本公开中所述的hRSVF蛋白变异体为经人工突变和改造的F蛋白，所述突变和改基础，将图1显示hRSVF蛋白野生型全长氨基酸的第46位的S氨基酸残基替换为G氨基酸残9[0083]包含mRNA和LNP的核酸分子疫苗可分散在碱或媒介物中，所述碱或媒介物可包含[0084]本公开的核酸分子疫苗可替代地包含接近生理条件所需的作为药学上可接受的[0087]一种包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤[0093]利用荧光素酶作为报告基因，通过活体荧光成像技术研究不同疫苗载体的配方小鼠体内荧光素酶表达)在小鼠体内递送编码荧光素酶基因的mRNA的效率，并检测不同复米颗粒中的包封率从而使其具有更高的稳定性，此外适度提高配方中聚乙二醇(PEG)的含[0098]不同配方的阳离子脂质纳米颗粒包裹编码S蛋白全长的mRNA的能力及形成纳米颗粒的粒度数据如表2所示，几种配方均能将S蛋白mRNA压缩成粒径100nm以下表面电位净中[0117]使用小鼠IL_4ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)和小鼠IFN_γELISA[0121]表格3中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格3所述的mRNA序列按照实施例1所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质[0124]编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述表格中的阅读框序列外，还包[0125]样品Y1为包含编码RSVF糖蛋白野生型氨基酸序列(Wt)的RNA的脂质纳米颗粒；样品Y2编码的氨基酸序列以RSVF糖蛋白野生型为基础，将TM序列去除，在C末端添加FibritinDominain(氨基酸序列如SeqIDNO.3所示)；Y3编码的氨基酸序列发生S155C/FibritinDominain(氨基酸序列如SeqIDNO.3所示)；Y5编码的氨基酸序列发生S46G/[0126]按照实施例4的方法对制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒进[0132]RSVF糖蛋白变异体mRNA疫苗免疫组的IFN_γ较PBS对照组有显著升高(P<0.01)(Th1型细胞免疫应答)，而RSVF突变体mRNA疫苗免疫组的IL_4较PBS对照组也[0136]表格4中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格4所述的mRNA序列按照实施例2所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质[0137]编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述表格中的阅读框序列外，还包[0140]按照实施例4的方法对制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒进[0142]Fig.7A～7D分别为将血清从100倍～100万倍稀释后，通过间接ELISA测定的[0143]结果表明，RSVF糖蛋白变异体mRNA疫苗免疫组IgG抗体效价均显著高于PBS对照[0145]RSVF糖蛋白变异体mRNA疫苗免疫组的IFN_γ较PBS对照组有显著升高(P<0.01)糖蛋白变异体mRNA疫苗可刺激小鼠的Th1型细胞[0149]二免12d后，RSV活病毒嗜班减少实验检测小鼠血清中RSV中和抗体滴度。如图所[0151]将呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变异体的C_末端前肽分别用氨基酸序列如Seq抗原hRSVF蛋白变异体的C_末端前肽序列为野生型的TM序列。[0152]表格5中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格5中所述的mRNA序列按照实施例2所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质[0155]编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述表格中的阅读框序列外，还包[0156]将制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒按照实施例4所述方法[0157]除表格5所示的呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变异体(氨基酸序列如SeqID呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变异体的氨基酸序列，根据新氨基酸序列设计和制备相应[0160]将呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变异体的RR2区氨基酸序列进行突变，得到氨[0161]按照实施例1所述的方法制备将表格6中所示的mRNA制备为编码合胞病毒RNA疫苗[0162]制备的脂质纳米颗粒，按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价。实验结果见[0163]除本实施例中所示的呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变异体(氨基酸序列如Seq基酸序列设计和制备相应的包含编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA脂质纳米颗粒，并按[0166]表格6中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格4所述的mRNA序列按照实施例2所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒。制备的