NYT 4742-2025 牛轮状病毒感染诊断技术标准立项发展报告

牛轮状病毒感染诊断技术标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:DiagnosticTechniquesforBovineRotavirusInfection摘要牛轮状病毒（BovineRotavirus,BRV）是引起新生犊牛腹泻最主要的病毒性病原体之一，在全球范围内广泛流行，每年给养牛业造成巨大的经济损失。随着我国畜牧养殖业向规模化、集约化方向快速发展，牛群流动性增大，牛轮状病毒病的防控形势日趋严峻，建立统一、规范、灵敏、特异的诊断技术标准已成为产业发展的迫切需求。在此背景下，中华人民共和国农业农村部于2025年4月27日发布行业标准NY/T4742-2025《牛轮状病毒感染诊断技术》，并于2025年8月1日正式实施。本标准确立了牛轮状病毒感染的临床诊断、病原学检测和血清学检测等技术要求，系统规范了样品采集与处理、病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和试验、琼脂凝胶免疫扩散试验等关键技术操作程序，并对结果判定标准作出了明确界定。本标准的发布填补了我国在牛轮状病毒感染诊断领域农业行业标准层面的空白，为基层兽医实验室和各级动物疫病预防控制机构提供了统一可靠的技术依据，对提升我国牛轮状病毒病的监测预警能力、规范诊断操作流程以及保障奶牛和肉牛养殖业持续健康发展具有重要的现实意义和应用价值。关键词：牛轮状病毒；诊断技术；行业标准；聚合酶链式反应；酶联免疫吸附试验；犊牛腹泻AbstractBovinerotavirus(BRV)isoneofthemostimportantviralpathogenscausingdiarrheainneonatalcalves,withworldwideprevalenceandsignificanteconomiclossestothecattleindustryannually.WiththerapiddevelopmentofChina'slivestockindustrytowardlarge-scaleandintensiveproduction,theincreasingmobilityofcattleherdshasmadethepreventionandcontrolofbovinerotavirusdiseaseincreasinglychallenging.Theestablishmentofunified,standardized,sensitive,andspecificdiagnostictechnicalstandardshasbecomeanurgentdemandforindustrialdevelopment.Againstthisbackground,theMinistryofAgricultureandRuralAffairsofthePeople'sRepublicofChinaissuedtheindustrystandardNY/T4742-2025*DiagnosticTechniquesforBovineRotavirusInfection*onApril27,2025,whichwasofficiallyimplementedonAugust1,2025.Thisstandardestablishesthetechnicalrequirementsforclinicaldiagnosis,etiologicaldetection,andserologicaldetectionofbovinerotavirusinfection,systematicallystandardizingkeytechnicalproceduresincludingsamplecollectionandprocessing,virusisolationandidentification,RT-PCR,real-timefluorescentquantitativeRT-PCR,ELISA,virusneutralizationtest,andagargelimmunodiffusiontest,withclearcriteriaforresultinterpretation.TheissuanceofthisstandardfillsthegapattheagriculturalindustrystandardlevelinthefieldofbovinerotavirusinfectiondiagnosisinChina,providingunifiedandreliabletechnicalbasisforgrassrootsveterinarylaboratoriesandanimaldiseasepreventionandcontrolinstitutionsatalllevels.Ithassignificantpracticalimplicationsandapplicationvalueforenhancingthemonitoringandearlywarningcapabilitiesofbovinerotavirusdisease,standardizingdiagnosticprocedures,andensuringthesustainableandhealthydevelopmentofdairyandbeefcattleindustries.Keywords:Bovinerotavirus;Diagnostictechniques;Industrystandard;Polymerasechainreaction;Enzyme-linkedimmunosorbentassay;Calfdiarrhea1引言1.1标准编制背景牛轮状病毒隶属呼肠孤病毒科（*Reoviridae*）轮状病毒属（*Rotavirus*），为分节段的双链RNA病毒，其基因组由11个RNA片段构成，编码6种结构蛋白（VP1-VP4、VP6、VP7）和5种非结构蛋白（NSP1-NSP5）。根据VP6抗原差异，轮状病毒可分为A-J共10个群（种），其中A群轮状病毒是导致犊牛病毒性腹泻最主要的病原，亦可感染人类及其他多种动物，具有重要的人兽共患公共卫生意义。该病毒自1969年首次从犊牛腹泻粪便中被分离鉴定以来，已在全球养牛国家广泛传播。流行病学调查数据显示，我国多个省份的规模化和散养牛场中牛轮状病毒血清阳性率普遍处于较高水平，感染率可达30%～80%不等，尤其对7日龄以内的新生犊牛危害最为严重，致死率可达20%～50%，不仅直接造成犊牛死亡损失和生长发育受阻，还因治疗成本增加、生产性能下降等因素给养殖企业带来沉重的经济负担。当前，我国养牛业正处于由传统养殖模式向标准化、规模化、智能化养殖转型的关键时期，牛群交易流通频繁，疫病跨区域传播风险加大。然而，在NY/T4742-2025发布之前，我国尚无专门针对牛轮状病毒感染诊断的农业行业标准或国家标准，各实验室在实际操作中参考的技术方案来源多样，包括国外OIE（世界动物卫生组织）推荐方法、教科书经典方案及各机构自制操作规程等。由于检测方法不统一、操作流程不规范、结果判读标准不一致，导致不同实验室间的检测结果可比性差，在一定程度上制约了牛轮状病毒病的有效防控和净化工作。因此，制定统一、科学的牛轮状病毒感染诊断技术标准势在必行。1.2标准制定必要性分析（1）产业发展的迫切需求。我国奶牛肉牛存栏量持续增长，2024年牛奶产量达到4079万吨，肉牛出栏量稳步上升，养牛业在畜牧经济中的比重不断加大。牛轮状病毒感染作为制约犊牛成活率的重要因素，其精准诊断与有效防控直接关系产业效益。（2）公共卫生安全的内在要求。轮状病毒具有跨物种传播的潜力，A群轮状病毒可在人和多种动物间发生基因重配和跨种传播。规范牛轮状病毒的诊断技术，不仅服务于动物疫病防控，同时对评估和控制人兽共患传播风险具有重要的公共卫生意义。（3）标准化体系建设的客观需要。我国动物疫病诊断技术标准体系正在逐步完善，但相对于口蹄疫、牛结核病等重大动物疫病，针对牛轮状病毒等常见多发性疫病的诊断标准尚显不足。该标准的发布有效填补了这一空白。1.3编制依据与原则本标准的编制严格遵守《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国标准化法》等法律法规的要求，依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》进行编写，在技术内容上充分参考了世界动物卫生组织（WOAH，原OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中关于轮状病毒诊断的相关技术规范，同时结合我国兽医实验室检测条件的实际现状，确保标准的科学性、先进性和可操作性。2标准主要内容2.1标准适用范围本标准规定了牛轮状病毒感染的临床诊断、病原学检测和血清学检测的技术要求，适用于牛轮状病毒感染的诊断、监测、检疫以及流行病学调查等工作中对牛粪便样品、肠道组织样品及血清样品中牛轮状病毒抗原、核酸及特异性抗体的检测。标准适用范围明确，涵盖了从疑似病例的临床初诊到实验室确诊的全流程检测需求，兼顾了不同层级实验室的技术条件和应用场景差异。2.2临床诊断临床诊断部分系统描述了牛轮状病毒感染的流行病学特征和临床表现。该病主要侵害新生犊牛，以7日龄以内的犊牛最为易感，发病急、传播快，呈暴发性或地方流行性。典型临床症状包括精神沉郁、食欲减退或废绝、排出黄色或灰白色水样或糊状稀便、脱水、电解质紊乱等，严重者可在数小时内出现虚脱甚至死亡。流行病学特征方面，该病多发生于冬季和早春寒冷季节，卫生条件差、饲养密度大、初乳管理不当等因素均可诱发和加重疫情。临床诊断内容为基层兽医人员提供了基础性的初步判断依据，但标准同时明确指出，鉴于多种病原（如牛冠状病毒、大肠杆菌K99、隐孢子虫等）均可引起犊牛腹泻且症状相似，仅凭临床症状难以进行确定性鉴别诊断，确诊须结合病原学或血清学检测结果综合判定，有效防范了临床误诊的风险。2.3样品采集与处理样品的规范采集与前处理是保证检测结果准确可靠的基础环节。标准对样品采集的时间窗口、部位、方法、数量、包装标识及运输保存条件均作出了明确规定：-病原学检测样品：以直肠粪便或肛拭子为主，宜在发病急性期（腹泻开始后24~48小时内）采集，此时粪便中病毒含量最高，检出率最大。粪便样品应置于无菌密封容器中，冷藏条件下（2~8℃）应在24小时内送达实验室，如无法及时检测则应冷冻保存（-20℃以下），长期保存需置于-80℃或液氮中，避免反复冻融以防病毒RNA降解。-血清学检测样品：应无菌采集静脉血液，分离血清后冷藏运送，保存期不超过1周时可在2~8℃条件下存放，长期保存应在-20℃以下。-组织样品：对死亡病例，应尽快采集空肠、回肠段及肠内容物，置于含抗生素的病毒运输液中冷藏送检。2.4病原学检测方法病原学检测是确诊牛轮状病毒感染最为可靠的实验室手段，标准涵盖了以下三种方法。（1）病毒分离鉴定。病毒分离是牛轮状病毒感染诊断的经典“金标准”方法，也是获得病毒分离株进行后续分子生物学研究的基础。标准推荐使用MA-104细胞系（非洲绿猴肾细胞）进行病毒分离培养，将处理后的粪便样品接种细胞单层，盲传2~3代后观察细胞病变效应（CPE），轮状病毒典型CPE表现为细胞圆缩、折光性增强、融合及脱落。对出现CPE的培养物，可进一步采用免疫荧光试验（IFA）或RT-PCR方法进行病毒确认。鉴于病毒分离周期长（通常需5~14天）、对样品质量要求高、需要专业细胞培养设施等条件限制，该方法在基础实验室中的应用受到一定制约，更多用于参考实验室的确证和科研用途。（2）RT-PCR检测方法。反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）具有灵敏度高、特异性强、检测快速等优点，已广泛应用于牛轮状病毒的常规检测。标准中详细规定了引物设计原则、反应体系配制、扩增程序参数及扩增产物分析鉴定方法。针对牛轮状病毒基因组分节段且易发生变异的特点，标准推荐以高度保守的VP6基因片段作为检测靶基因，确保方法的广谱性和检出率。核酸提取可采用传统TRIzol法或商品化核酸提取试剂盒，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，根据特异性条带的有无进行结果判定。该方法检出限可达10²～10³拷贝/反应，适用于各级兽医实验室的日常检测工作。（3）实时荧光定量RT-PCR方法。实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）在常规RT-PCR基础上引入荧光探针（TaqMan探针法），实现了对扩增过程的实时监测和绝对定量分析。该方法不仅能够定性检测牛轮状病毒核酸的存在，还可精确测定样品中的病毒载量，为临床病情评估、排毒动态监测、消毒效果评价等提供更为精细的数据支撑。标准在方法学上规定了标准曲线的建立方法、阳性对照与阴性对照的设置要求、扩增效率的验证标准（90%～110%）以及Ct值的判定阈值等关键性能参数。该方法灵敏度较常规RT-PCR高出1~2个数量级，特异性同样优秀，且闭管检测大幅降低了扩增产物污染风险，在大规模流行病学调查和净化工作中具有突出的应用前景。标准同时给出各方法性能比对数据，为不同实验室根据自身条件选择适宜方法提供了依据。2.5血清学检测方法标准收录的血清学检测方法包括以下三种。（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）。双抗体夹心ELISA法用于检测粪便样品中的牛轮状病毒抗原，具有操作简便、无需特殊仪器设备、结果可肉眼判读等优势，非常适用于基层实验室的批量筛查，也是目前国内外牛轮状病毒抗原检测应用最为广泛的方法。间接ELISA法则用于检测血清中特异性IgG抗体水平，适用于感染史调查和疫苗免疫效果评估。标准对ELISA试验的包被抗体选择、封闭条件、洗涤程序、阴阳性临界值（OD值）计算方法等关键环节进行了规范，确保不同实验室间的检测结果具有可比性。该方法可在2~4小时内完成全部检测流程。（2）病毒中和试验（VNT）。病毒中和试验是检测牛轮状病毒特异性中和抗体的经典方法，也是评估动物免疫保护水平的参考方法。其原理为待检血清中的特异性中和抗体与病毒结合后，可阻断病毒对敏感细胞（MA-104）的感染，通过观察细胞病变的抑制情况判定抗体效价。标准详细规定了病毒滴定、血清灭活、中和反应条件（37℃作用1小时）、细胞接种、结果判读（以能抑制50%以上细胞病变的最高血清稀释度作为中和抗体效价）等操作程序。该方法的不足之处在于耗时较长（需3~5天）、依赖活病毒和细胞培养体系，一般仅在有相应条件的专业实验室中开展。（3）琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）。琼脂凝胶免疫扩散试验是基于抗原抗体在琼脂凝胶中双向扩散形成特异性沉淀线的原理建立的方法，操作简单、无需特殊设备、成本低廉。该方法虽然灵敏度和特异性相对较低，但在资源有限的基层实验室中仍具有应用价值，可作为辅助诊断手段使用。2.6结果判定与质量控制标准对各项检测方法的结果判定标准给出了明确界定，并针对样品采集、试剂保存、仪器校准、阴阳性对照设置等全流程提出了系统的质量控制要求。标准明确规定：病原学检测中，病毒分离阳性、RT-PCR/qRT-PCR检测阳性或ELISA抗原检测阳性，均可判定为牛轮状病毒感染阳性；血清学检测中，双份血清（急性期和恢复期）抗体滴度呈4倍及以上升高者，具有诊断意义。每批次检测必须同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，以监控试验全过程的有效性。这些规定为检测结果的可信度提供了有力保障，也是本标准的突出亮点。3标准发布信息与实施安排NY/T4742-2025《牛轮状病毒感染诊断技术》由中华人民共和国农业农村部于2025年4月27日以行业标准形式正式发布，编号为NY/T4742-2025，分类号为兽医学，自2025年8月1日起在全国范围内实施。该标准为现行有效标准，适用于全国各级动物疫病预防控制机构、兽医实验室、检验检疫机构、科研院所及相关养殖企业。4主要起草单位介绍本标准的主要起草单位包括中国动物卫生与流行病学中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、全国畜牧总站等权威技术机构。以下重点介绍中国动物卫生与流行病学中心。中国动物卫生与流行病学中心（ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,CAHEC）是隶属于农业农村部的正局级事业单位，总部位于山东省青岛市，是我国动物疫病防控体系中的国家级技术支撑机构。中心前身为成立于1979年的农业部动物检疫所，经过四十余年的发展建设，现已形成涵盖动物疫病监测预警、流行病学调查、诊断技术研发、标准制定修订、风险评估分析等多项核心职能的综合性技术平台。中心设有国家外来动物疫病诊断实验室、国家动物流行病学研究中心等国家级技术平台，建有生物安全三级（BSL-3）实验室、分子生物学实验室、血清学检测实验室等多个功能单元，配备有高通量荧光定量PCR仪、二代基因测序仪、超速离心机等大型精密仪器设备，具备从事高致病性动物疫病和重要人兽共患病的病原分离鉴定、分子溯源和诊断技术研发的完善硬件条件。中心拥有一支以兽医学、微生物学、分子生物学、流行病学等多学科交叉的高水平科研团队，现有专业技术人员200余人，其中高级职称人员占比超过40%，具有博士学位人员超过50%，形成了一批在国内动物疫病诊断领域具有重要影响力的学科带头人和技术骨干。在标准化工作方面，中国动物卫生与流行病学中心长期以来积极参与农业行业标准的制修订工作，承担全国动物卫生标准化技术委员会相关分