枸杞干果中硫胺素和核黄素含量的测定 液相色谱法

枸杞干果中硫胺素和核黄素含量的测定液相色谱法1范围本规程规定了采用高效液相色谱法测定枸杞干果中硫胺素（维生素B₁）和核黄素（维生素B₂）含量的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、色谱条件、测定步骤、结果计算、精密度、准确度及注意事项。本规程适用于各类枸杞干果中硫胺素和核黄素含量的定量测定，检出限、定量限满足常规检测需求，其他浆果类干果可参照执行。2术语和定义硫胺素（Thiamine）：即维生素B₁，分子式C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl，水溶性维生素，在酸性条件下稳定，高温、碱性环境易分解，具有特定的紫外吸收特性。核黄素（Riboflavin）：即维生素B₂，分子式C₁₇H₂₀N₄O₆，水溶性维生素，对光敏感，尤其在碱性条件下易被光破坏，具有黄绿色荧光，可通过高效液相色谱法分离检测。高效液相色谱法（HPLC）：采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，各组分在固定相和流动相之间进行反复分配，因分配系数不同而实现分离，经检测器检测后实现定性定量分析的方法。回收率：样品中添加已知量的标准物质后，经前处理和检测，实际测得的标准物质含量与添加量的比值，用于评价方法的准确度。3原理枸杞干果中的硫胺素和核黄素经盐酸溶液提取、酶解（去除样品基质干扰）后，通过固相萃取或离心过滤净化，去除样品中的大分子杂质、色素等干扰组分。采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，适宜的缓冲液-有机相为流动相，对净化后的提取液进行洗脱分离，硫胺素和核黄素在特定波长下有最大吸收，根据保留时间定性，外标法峰面积定量，计算样品中两种物质的含量。核黄素具有强烈的黄绿色荧光，可辅助定性鉴别；硫胺素和核黄素均有特征紫外吸收峰，可通过吸收波长差异实现有效分离检测，参考高效液相色谱法相关规范优化分离条件，确保两种组分峰形对称、分离度满足检测要求。4试剂与材料4.1试剂除非另有说明，所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（电导率≤18.2μS/cm，25℃）。盐酸（HCl）：优级纯，浓度36%～38%。氢氧化钠（NaOH）：分析纯，用于调节提取液pH值。冰醋酸（CH₃COOH）：分析纯，用于配制流动相缓冲液。三乙胺（C₆H₁₅N）：分析纯，用于调节流动相pH值，改善峰形。甲醇（CH₃OH）：色谱纯，用于配制流动相和标准溶液。硫胺素标准品（纯度≥99.0%）：编号、批号清晰，置于棕色瓶中避光保存。核黄素标准品（纯度≥99.0%）：编号、批号清晰，具有黄绿色荧光特性，置于棕色瓶中避光保存，避免光照分解。淀粉酶：活力≥100U/mg，用于酶解样品中的淀粉类杂质，释放结合态的硫胺素和核黄素。磷酸二氢钾（KH₂PO₄）：分析纯，用于配制缓冲液。盐酸羟胺溶液（3→20）：取3g盐酸羟胺，加超纯水溶解并定容至20mL，现配现用，用于核黄素的辅助鉴别与稳定。4.2试剂配制盐酸溶液（0.1mol/L）：量取8.3mL盐酸，缓慢加入超纯水中，搅拌均匀，定容至1000mL，摇匀备用。氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠，加适量超纯水溶解，冷却后定容至1000mL，摇匀备用。醋酸-三乙胺缓冲液（pH=4.5）：取10mL冰醋酸与5mL三乙胺，加超纯水定容至1000mL，搅拌均匀，用冰醋酸或三乙胺微调pH至4.5，经0.45μm滤膜过滤后备用，用于流动相配制。标准储备液：分别精密称取硫胺素标准品10.0mg、核黄素标准品10.0mg，置于两个100mL棕色容量瓶中，加少量甲醇溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀，得到浓度为100μg/mL的硫胺素、核黄素标准储备液，4℃避光冷藏，有效期1个月。标准工作液：精密量取标准储备液适量，用超纯水逐级稀释，配制浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的混合标准工作液，现配现用，置于棕色瓶中避光保存，避免光照导致核黄素分解。淀粉酶溶液：称取1g淀粉酶，加100mL超纯水溶解，摇匀，现配现用。4.3材料滤膜：0.45μm有机相滤膜、0.22μm有机相滤膜，用于流动相和样品提取液过滤。固相萃取小柱：C₁₈固相萃取小柱（500mg/6mL），用于样品提取液净化，去除色素等干扰杂质。离心管：50mL、10mL，聚四氟乙烯材质，耐酸耐碱。棕色容量瓶：10mL、50mL、100mL，用于标准溶液和样品提取液定容，避免光照影响。5仪器设备高效液相色谱仪：配备紫外-可见检测器（或荧光检测器），具备高压输液系统、柱温箱、进样器，性能符合GB/T26792《高效液相色谱仪》要求。分析天平：精度0.1mg和0.001g，用于样品和标准品称量。高速冷冻离心机：转速≥8000r/min，温度可调节（0～4℃），用于样品提取液离心净化。恒温水浴锅：控温精度±1℃，温度范围30～100℃，用于样品酶解和提取。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz，用于样品提取辅助溶解。固相萃取装置：真空度可调节，用于样品提取液固相萃取净化。pH计：精度±0.01，用于调节试剂和样品提取液的pH值。粉碎机：用于枸杞干果粉碎，粉碎后过40目筛，确保样品均匀。烘箱：控温精度±1℃，用于样品干燥（如需）。移液管：1mL、2mL、5mL、10mL，精度符合A级要求，用于试剂和标准溶液移取。棕色样品瓶：用于储存样品提取液和标准工作液，避光保存。6样品处理6.1样品制备取枸杞干果样品，去除杂质、破损颗粒，置于烘箱中60℃干燥至恒重（若样品水分含量较低，可直接粉碎），冷却至室温后，用粉碎机粉碎，过40目筛，充分混匀，置于干燥密封容器中保存，避免吸潮和光照，备用。枸杞干果需符合GB/T18672-2002《枸杞(枸杞子)》相关要求，确保样品无霉变、无二氧化硫超标等问题。6.2样品提取精密称取制备好的枸杞干果粉末2.000g，置于50mL离心管中，加入25mL0.1mol/L盐酸溶液，摇匀，超声提取30min（功率200W，频率40kHz，温度控制在30℃以下，避免高温破坏硫胺素和核黄素），加入1mL淀粉酶溶液，摇匀后置于45℃恒温水浴锅中酶解60min，期间每隔15min摇匀一次。酶解完成后，取出冷却至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.0～5.0，转移至50mL棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，静置10min。6.3样品净化将上述定容后的样品溶液转移至离心管中，8000r/min、4℃离心15min，取上清液，经0.45μm有机相滤膜过滤，弃去初滤液（约1mL），取续滤液备用；若样品基质干扰较大（色素较多），可将续滤液通过预处理后的C₁₈固相萃取小柱（先用5mL甲醇活化，再用5mL超纯水平衡）