CN119120431B 一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的复合酶及其制备方法与应用 （谷雨生物科技集团股份有限公司）

388号22栋中科院长春应化所黄埔先KR20160014096A,2016.02.05一种高效转化高纯度稀有人参皂苷CK的复本发明涉及一种高效转化高纯度稀有人参具有协同增效将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷CK2A1、对来源于土壤中华单胞菌的β_葡萄糖苷酶进行密码子优化，通过B2、当溶氧下降至60_70％时，调温至23_27℃并开始补料，第一小时补料速度190_3.如权利要求1或2所述的复合酶，其特征在于13000U/g，所述果糖基转移酶的酶活力为2500_3000U/g，所述乳糖酶的酶活力为5500_6000U/g，所述纤维素酶的酶活力为9000_10000U/g，所述β_葡聚糖酶的酶活力为6000_4.如权利要求1_3任一项所述的复合酶在制备人参皂苷C(3)以体积百分比为40_95％的乙醇溶液作为溶剂与步骤(2)所得沉淀B混合制备为复3(聂)在步骤(1)中，含有人参皂苷Rb1的提取物与复合酶的重量比为含有人参皂苷Rb14苷酶与浓度为10mg/mL人参皂苷Rb1反应生成人参皂苷CK，人参皂苷CK的转化效率为62一[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高效转化高纯度稀有人56[0026]作为本发明所述复合酶的优选实施方式，所述β_葡萄糖苷酶的酶活力为12000_13000U/g，所述果糖基转移酶的酶活力为2500_3000U/g，所述乳糖酶的酶活力为5500_6000U/g，所述纤维素酶的酶活力为9000_10000U/g，所述β_葡聚糖酶的酶活力为6000_[0027]作为本发明所述复合酶的优选实施方式，所述β_葡萄糖苷酶的酶活力为12000U/Rb1的提取物与磷酸缓冲液的重量比为含有人参皂苷Rb1的提取物：磷酸缓冲液＝1：(10_[0035](3)以体积百分比为40_95％的乙醇溶液作为溶剂与步骤(2)所得沉淀B混合制备7发明的转化方法中当底物浓度为1％时，每1000g人参皂苷Rb1的提取物能够获得526g人参8酶和β_葡聚糖酶四种酶混合搭配使用，可以协同提高人参皂苷Rb1的转化为人参皂苷CK的[0059]图3为本发明效果例1中实施例1所得复合酶按照实施例4方法制备得到的人参皂[0060]图4为本发明效果例3中不同人参皂苷CK的稳定性测试结果，图中A为稳定性测试[0063]本发明所述含有人参皂苷Rb1的提取物的来源不作限定，只需明确其中含有人参9[0074]同源重组技术按照clonExpress8IIOneStepCloningKit(单片段)说明书进行，连接条件为37℃30min，clonExpre技股份有限公司提供，货号为C112，经同源重组技术组装所得的质粒或表达基因簇转入照上述方法保存或活化备用。液为2×RapidTaqMasterMix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为P222_01，22[0111]1.5将步骤1.4所得1L二级种子液接种至50L发酵罐中，发酵罐装有30L发酵培养[0125]本发明复合酶及其制备方法的两种实施例，实施例3_4所述复合酶的组分及其用苷Rb1的提取物与1mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)在反应釜中按照200rpm的转速混合，按照含有人参皂苷Rb1的提取物：复合酶＝1:0.25的重量比加入实施例1所得复合酶溶液，采用高低温循环箱设置为150±5℃、冷却水箱设[0139]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和复合酶的重量比调整为含有人参皂苷[0146]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和磷酸钠缓冲液的重量比调整为含有人[0147]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和复合酶的重量比调整为含有人参皂苷[0155]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和磷酸钠缓冲液的重量比调整为含有人[0159]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和磷酸钠缓冲液的重量比调整为含有人[0162]本发明复合酶及其制备方法的两种对比例，对比例1_6所述复合酶的组分及其用[0167]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和磷酸钠缓冲液的重量比调整为含有人[0168]在步骤S1中，含有人参皂苷Rb1的提取物和复合酶的重量比调整为含有人参皂苷[0174]按照实施例5的方法采用实施例2_4、对比例1_7所得复合酶制剂以制备得到人参[0178]待测样品的人参皂苷CK含量≥10％的人参皂苷CK固体粉末试样称取0.2_0.5g(精应对样品进行适当稀释并选择合适的标准曲线范04016.504016.5够高效利用人参皂苷Rb1使其转化人参皂苷CK，所制备得到的产物中人参皂苷CK的含量达[0191]采用实施例2所得复合酶按照实施例5的方法对3批次含有人参皂苷Rb1的提取物[0194]如表8所示，不同批次证实本发明的复合酶及高效转化高纯度人参皂苷CK的方法[0196]采用实施例2所得复合酶制剂分别按照实施例5_9、对比例8的方法以制备得到人苷CK(命名为