象甲科仓储害虫分子鉴别技术规程征求意见稿

ICS FORMTEXTXXXXX.XXFORMTEXTXXXT/xxxxxxxxxT/xxxxxxxxxxxx.x—2022FORMTEXT象甲科仓储害虫分子鉴别技术规程Technicalregulationsformolecularidentifyingcommonstored-productpestsofwithweevilsDNAbarcodeFORMTEXT（征求意见稿）FORMTEXT2022-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXT2022-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT宜宾市市场监督管理局发布T/xxxxxxxxxxxx.x—2022目  次 I前  言 II象甲科仓储害虫分子鉴别技术规程 11范围 12规范性引用文件 13术语和定义 13.1 1DNA条形码（DNAbarcodes） 13.2 1COI基因（COIgene） 14工作原理 15仪器设备及试剂 15.1仪器设备 25.2试剂 26DNA条形码分子鉴定 26.1样品基因组DNA的提取 26.2DNA提取质量的检测 26.3条形码COI基因的扩增及检测 36.4COI基因序列的测定及序列处理 37结果判断 3附件A.1. 4附件A.2. 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由XXX提出并归口。本文件起草单位：宜宾学院，成都市农林科学院。本文件主要起草人：范围本文件规定了象甲科仓储害虫分子鉴别技术规程的术语和定义、工作原理、仪器设备及试剂、DNA条形码分子鉴定和结果判断的相关要求。本文件适用于仓储象甲DNA条形码的测定、结果的比对分析和判定，属于害虫监测和防控。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。DNA条形码（DNAbarcodes）生物体内一段短的、标准化的DNA片段，用于区分不同的物种.该片段在物种间有足够的变异、容易进行PCR扩增。COI基因（COIgene）线粒体基因组的蛋白编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxidasesubunitI,COI),该片段在物种间有足够的变异、易进行PCR扩增且重复性好，被证实能对很多动物物种进行高效区分，是进行DNA条形码分子鉴定的首选目的基因。工作原理根据仓储象甲的DNACOI序列特征，应用DNA条形码分子鉴定技术对仓储象甲进行鉴定。通过对一段标准化基因——线粒体COI序列的扩增和分析来实现对生物物种准确、快速鉴定的技术COI基因在动物物种之间序列位点信息具有足够的差异性，且能被通用引物广泛扩增，能够成功地在DNA水一平上区分动物物种。仪器设备及试剂仪器设备5.1.1高速冷冻离心机：最高转速≥20000rpm5.1.2微量核酸浓度检测仪:吸光率精度≤0.002A（1mm光程）5.1.3PCR扩增仪：反应体积10-100ul5.1.4电泳仪:功率75w5.1.5凝胶成像系统5.1.6生物安全柜5.1.7高压灭菌锅5.1.8解剖镜5.1.9天平5.1.10摇床5.1.11水浴锅5.1.12制冰机5.1.13旋涡振荡器5.1.14冰箱、-80℃冰箱5.1.15微量移液器：1ul、5ul、10ul、50ul试剂5.2.1仓储象甲基因组DNA的提取可采用市售基因组DNA提取试剂盒5.2.2酚5.2.3氯仿5.2.4TAE电泳缓冲液5.2.5NaAc溶液:3MpH5.25.2.6PCR反应缓冲液：10x5.2.7TE缓冲液5.2.8蛋白酶K溶液:PROTEINASEK,20MG/ML5.2.9TaqDNA聚合酶5.2.10脱氧核昔三磷酸（dNTPs）引物：扩增引物（具体引物对见附件A.1.）,5.2.11委托生物公司合成DL2000：DNA标准分子量5.2.12无水乙醇5.2.13琼脂糖5.2.14异戊醇抽提液5.2.15染色剂:EB或市售其他染色剂DNA条形码分子鉴定样品基因组DNA的提取基因组DNA提取：采用市售基因组DNA提取试剂盒对仓储象甲单头样品DNA或供试储粮象甲的总DNA进行提取，具体提取方法依照试剂盒使用说明书。DNA提取质量的检测微量光吸收检测仪检测法：取1uLDNA模板溶液在微量核酸浓度检测仪进行检测，PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7-1.9。条形码COI基因的扩增及检测扩增的单头仓储象甲条形码COI基因，均使用通用引物对LCO1490/HCO2198，可自行配制PCR体系，也可采用市售PCRmix体系进行扩增。PCR扩增采用50μL反应体系；象甲DNA模板5μL，10×Buffer5μL，dNTPs2μL，10×Taq酶1μL，引物各10μL，引物浓度为10μmol/L。扩增条件：95℃预变性5min；然后按以下反应条件进行35个循环：95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃延伸7min。4℃保存。产物检测：取5μLPCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳条件120V，约30min。电泳结束后溴化乙锭（EB）染色10min（或其它市售染色剂，参照说明进行染色），用凝胶成像系统观察、拍照。COI基因序列的测定及序列处理将获取的PCR反应产物进行纯化并委托DNA测序公司双向测序，测序原理同Sanger测序法。为确保测序结果的可靠性，需对测序质量进行评估，质量评估以碱基的Q值为依据去除测序结果两端的低质量序列，应用具有序列拼接功能的常规软件（例如DNAMAN）进行序列拼接去除两端引物序列。结果判断剪切后的COI基因序列长度为484bp判定为米象，长度为129bp的判定为玉米象，其它约700bp的登录GcnBank数据库BLAST鉴定系统，在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，或直接和附录A.2.中已知象甲序列进行比对。当COI基因序列结果与已知仓储象甲种类基因序列相似度最高，且最大相似度大于或等于98%时，可明确判定待鉴定的物种为该物种。若待鉴定物种相似度低于98%，则应进行专业形态鉴定确认物种，之后获取该物种的COI基因序列，作为该物种的标准DNA条形码序列。附件A.1.用于鉴别米象和玉米象的引物对：SEQIDNO.1/2，SEQIDNO.1序列为：5’-CTAATTCGGGCAGAACTAGGAA-3’；SEQIDNO.2序列为：5’-AGAGGAGGAGAATAGCAGTGATTCTT-3’；引物对2序列为：SEQI