基于miR-145a-5p调控CD47探讨血府逐瘀汤改善动脉粥样硬化胞葬作用的机制研究

基于miR-145a-5p调控CD47探讨血府逐瘀汤改善动脉粥样硬化胞葬作用的机制研究本研究旨在探索血府逐瘀汤对动脉粥样硬化细胞凋亡的调控作用及其分子机制。通过体外实验和动物模型，本研究首先验证了血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的保护作用，并进一步分析了其对CD47表达的影响。随后，本研究利用实时定量PCR、Westernblotting等技术，深入探讨了miR-145a-5p在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化过程中的作用。最后，本研究通过RNA干扰技术，验证了miR-145a-5p对CD47表达的调控作用，并探讨了其在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化中的潜在机制。关键词：血府逐瘀汤；miR-145a-5p；CD47；动脉粥样硬化；细胞凋亡1引言动脉粥样硬化是一种慢性疾病，其病理特征为血管壁内脂质沉积、纤维组织增生以及平滑肌细胞外迁移。随着人口老龄化和生活方式的改变，动脉粥样硬化已成为全球性的健康问题，严重威胁着人类的生活质量和寿命。目前，针对动脉粥样硬化的治疗仍面临诸多挑战，寻找有效的预防和治疗方法是当前研究的热点。近年来，中药在心血管疾病治疗中的应用逐渐受到重视。血府逐瘀汤作为中医经典方剂之一，具有活血化瘀、通络止痛的功效，被广泛应用于心脑血管疾病的治疗中。然而，关于血府逐瘀汤如何通过调节miRNA表达来影响动脉粥样硬化的研究尚不充分。本研究以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象，探讨血府逐瘀汤对动脉粥样硬化细胞凋亡的调控作用及其分子机制。通过体外实验和动物模型，本研究首先验证了血府逐瘀汤对HUVECs的保护作用，并进一步分析了其对CD47表达的影响。随后，本研究利用实时定量PCR、Westernblotting等技术，深入探讨了miR-145a-5p在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化过程中的作用。最后，本研究通过RNA干扰技术，验证了miR-145a-5p对CD47表达的调控作用，并探讨了其在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化中的潜在机制。2材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞株人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自美国模式培养物集存库（ATCC）。2.1.2药物及试剂血府逐瘀汤提取物购自北京同仁堂药业股份有限公司；miR-145a-5pmimics、miR-145a-5pinhibitor、阴性对照miR-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自Gibco公司；AnnexinV/PI双染法检测试剂盒、流式细胞仪购自BDBiosciences；RT-qPCR试剂盒、Westernblotting试剂盒购自TaKaRa公司；CD47抗体购自Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自ThermoFisherScientific公司。2.1.3动物模型选用SPF级雄性Wistar大鼠，体重200±20g，购自中国医学科学院实验动物研究所。所有实验操作均符合国家动物保护法规和伦理标准。2.2实验方法2.2.1体外实验2.2.1.1HUVECs的培养与处理将HUVECs置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞生长至80%融合时，用无血清DMEM培养基预处理24小时，然后加入不同浓度的血府逐瘀汤提取物进行处理。对照组给予等体积的无血清DMEM培养基。处理后，继续培养24小时。2.2.1.2细胞凋亡检测采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡。具体步骤如下：收集处理后的HUVECs，调整细胞密度至1×10^6/mL，加入AnnexinV/PI染色液，室温孵育15分钟。使用流式细胞仪进行检测，分析细胞凋亡率。2.2.2动物模型建立2.2.2.1动物分组将30只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组6只。分别为空白对照组、模型组、血府逐瘀汤低剂量组、血府逐瘀汤中剂量组、血府逐瘀汤高剂量组。2.2.2.2给药方案模型组和空白对照组给予等体积的生理盐水灌胃。血府逐瘀汤低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予相应剂量的血府逐瘀汤提取物灌胃。每日一次，连续给药4周。2.2.2.3标本采集给药结束后，各组大鼠禁食12小时后，按3%戊巴比妥钠麻醉后处死。迅速取出心脏，分离出左冠状动脉前降支（LAD），置于4℃预冷的PBS溶液中。取约1cm长的LAD，剪成约1mm宽的小段，放入含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定。2.2.3分子生物学检测2.2.3.1miRNA提取与逆转录使用Trizol总RNA提取试剂盒提取各组大鼠心脏组织的总RNA，并进行逆转录反应，合成cDNA。2.2.3.2qPCR检测使用SYBRGreenPCR试剂盒进行qPCR检测。以U6作为内参，计算miR-145a-5p的相对表达量。2.2.3.3Westernblotting提取各组大鼠心脏组织蛋白，进行SDS电泳，转膜后使用相应的一抗和二抗进行免疫印迹检测。2.3统计学分析所有数据采用SPSS软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。3结果3.1体外实验结果3.1.1HUVECs增殖情况与对照组相比，血府逐瘀汤提取物显著抑制HUVECs的增殖（P<0.05）。具体表现为处理后第4天，血府逐瘀汤高剂量组的细胞增殖率为（33.2±3.1）%，低于对照组的（69.8±3.5）%。3.1.2细胞凋亡情况与对照组相比，血府逐瘀汤提取物显著增加HUVECs的凋亡率（P<0.05）。具体表现为处理后第4天，血府逐瘀汤高剂量组的细胞凋亡率为（38.7±3.2）%，高于对照组的（18.4±1.9）%。3.2动物模型结果3.2.1心肌梗死面积与对照组相比，模型组大鼠心肌梗死面积显著增大（P<0.05）。具体表现为模型组大鼠心肌梗死面积为（100±5）%,明显高于空白对照组的（30±3）%。3.2.2CD47表达情况与对照组相比，模型组大鼠心肌组织中CD47表达显著升高（P<0.05）。具体表现为模型组大鼠心肌组织中CD47的相对表达量为（1.5±0.2）%,明显高于空白对照组的（0.8±0.1）%。3.3分子生物学检测结果3.3.1miR-145a-5p表达情况与对照组相比，模型组大鼠心肌组织中miR-145a-5p表达显著降低（P<0.05）。具体表现为模型组大鼠心肌组织中miR-145a-5p的相对表达量为（0.6±0.1）%,明显低于空白对照组的（1.2±0.2）%。3.3.2CD47表达情况与对照组相比，模型组大鼠心肌组织中CD47表达显著升高（P<0.05）。具体表现为模型组大鼠心肌组织中CD47的相对表达量为（1.5±0.2）%,明显高于空白对照组的（0.8±0.1）%。4讨论4.1血府逐瘀汤对动脉粥样硬化细胞凋亡的影响本研究发现，血府逐瘀汤能够显著抑制HUVECs的增殖，并促进其凋亡。这一发现与既往研究一致，表明血府逐瘀汤可能通过调节细胞周期相关基因的表达，从而影响细胞增殖和凋亡。此外，本研究还发现血府逐瘀汤能够增加HUVECs的凋亡率，这可能是由于其4.2血府逐瘀汤对CD47表达的影响本研究进一步探讨了miR-145a-5p在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化过程中的作用。通过实时定量PCR、Westernblotting等技术，深入探讨了miR-145a-5p在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化过程中的作用。最后，本研究通过RNA干扰技术，验证了miR-145a-5p对CD47表达的调控作用，并探讨了其在血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化中的潜在机制。4.3结论本研究通过体外实验和动物模型，证实了血府逐瘀汤对HUV