《现代农业生物技术》课件-8 9-植物基因的分离与克隆

第四章园艺植物基因的分离与克隆Chapter4Cloning主要内容:基因工程中常用的工具酶基因克隆载体基因的分离基因克隆策略及过程001002004003第一节基因工程中常用的工具酶第一节基因工程中常用的工具酶3影响试管苗玻璃化的因素工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割特定的DNA位点DNA连接酶催化DNA相邻的5’磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶I①合成双链cDNA的第二条链；②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析④填补3’末端反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3’羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基一、限制性核酸内切酶RestrictionEndonuclease:endonuclease,aclassofendonucleaseenzymesthatidentifyspecificsequencesofDNAandcutdoublestrandsatoraroundtherecognitionsitestoformstickyorflatendsofDNA——概念RestrictionEndonuclease识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链形成粘末端或平末端的DNA的一类核酸内切酶。限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶3影响试管苗玻璃化的因素——性质I型II型III型酶分子的结构与功能三亚基多功能酶单一功能酶双亚基双功能酶限制与修饰作用的关系酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制作用的辅助因子ATP，Mg2+，SAMMg2+ATP，Mg2+，SAM识别序列特异性，非对称序列特异性，回文对称序列特异性，非对称序列切割位点距识别序列至少1000bp在识别序列内部或附近在识别序列下游24-26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割在基因克隆中的作用无应用价值应用广泛用处不大注：SAM为S-腺苷甲硫氨酸——类型滤膜孔径：022-04um。第一个字母取自产生该酶的细菌属名Haemophilus

，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名influenzae

，用小写；第四个字母代表株d

；用罗马数字表示发现的先后次序第三种酶。一、限制性核酸内切酶————命名rd29A启动子的酶切位点分析一、限制性核酸内切酶Twosequencescontainingthesamestructureandoppositedirectionsindouble-strandedDNAarecalledreverserepeatsequences,alsoknownaspalindromestructure回文结构（）每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。回文结构序列是一种旋转对称结构，在轴的两侧序列相同而反向。————Ⅱ类酶识别序列特点Palindromestructure双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构。II型限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶II————切口一、限制性核酸内切酶II——切口：Theviscousendreferstothecomplementarysequencesof5-and3Yater,whicharespecificallyincisionatedbyendonuclease一、限制性核酸内切酶II——切口Viscousend是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。粘性末端产生5'-粘性末端产生3'-粘性末端：一、限制性核酸内切酶II——切口Viscousend当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。平末端5′-CCCGGG-3′3′-GGGCCC-5′平端切口粘端切口一、限制性核酸内切酶II——切口：Althoughtherecognitionsequenceofsomerestrictionendonucleaseisnotexactlythesame,itproducesthesamestickyendaftercuttingDNA,whichiscalledisocaudalenzymeThesetwoidenticalviscousendsarecalledincompatibleends一、限制性核酸内切酶II——切口Incompatibleend有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。配伍未端一、限制性核酸内切酶II——切口反应体系反应条件：37或30℃水浴1-3h一、限制性核酸内切酶II——操作不同酶反应温度比一致酶切注意事项一、限制性核酸内切酶II酶切时间严格控制双酶切时从盐浓度低的开始切，再切盐浓度高的酶切体系不宜过大——操作一、限制性核酸内切酶II“星”活性：指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象。

产生“星”活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。结果是酶切条带增多。酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。

EcoRⅠ：GAATTCEcoRⅠ*：AATT甲基化：在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象。通常发生在5′胞嘧啶位置上，具有调节基因表达和保护DNA该位点不受特定限制酶降解

的作用。

识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。底物性状试剂：缓冲系统————影响限制酶活性的因素二、DNA聚合酶功能及类别：DNA聚合酶是催化DNA的合成（模板/引物/dNTP）及其相辅的活性，主要包括EcoliDNA聚合酶I、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶以及T7DNA聚合酶等。特点：都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。二、DNA聚合酶DNA聚合活性——（1）——大肠杆菌DNA聚合酶I聚合反应的特点聚合反应具有方向性:5’3’DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。二、DNA聚合酶——大肠杆菌DNA聚合酶I二、DNA聚合酶——大肠杆菌DNA聚合酶I随机引物标记核酸探针应用二、DNA聚合酶5’-粘端补平或3’端标记合成cDNA的第二链DNA序列分析3’-端的末端标记——大肠杆菌DNA聚合酶I二、DNA聚合酶——大肠杆菌DNA聚合酶IT4DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍；具有3’→5’外切酶活性强，可作用于ssDNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min；不具有5’→3’外切酶的活性，不从单链DNA模板上置换引物，因此在诱变反应中更有用。二、DNA聚合酶——T4DNA聚合酶二、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶。最适温度75℃~80℃。需要Mg2+(10mmol／L)，在低浓度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至01moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40mmol/L，KCl为60mmol/L。最适pH78(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性。自1976年分离纯化到此酶后，直至1985年PCR概念的形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因的克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大的作用。——T4DNA聚合酶三、连接酶LigaseisanenzymethatconnectstwosegmentsofnucleicacidThemainligasesareT4DNAligase,EcoliDNAligase,TaqDNAligaseandT4RNAligaseLigase是指将两段核酸连接起来的酶。主要的连接酶有T4DNA连接酶、EcoliDNA连接酶、TaqDNA连接酶和T4RNA连接酶。连接酶三、连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶是应用最多的一种连接酶，是由T4噬菌体感染大肠杆菌所产生的，其催化DNA5’-磷酸基与3’-羟基之间形成磷酸二脂键。T4DNA连接酶有以下几个用途：相同或相容粘性末端的连接；平整末端的相连。EcoliDNA连接酶EcoliDNA连接酶使用不多，与T4DNA连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与，其平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆。主要用于cDNA第二条链合成。三、连接酶TaqDNA连接酶TaqDNA连接酶连接两个寡核苷酸，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口。TaqDNA连接酶在PCR扩增中引入寡核苷酸，不可替代T4DNA连接酶，作用的温度为45~65℃，需NAD+，用于检测等位基因的变化。T4RNA连接酶T4RNA连接酶催化ssDNA或RNA的5’-磷酸和3’-羟基之间形成共价连接，其主要用于RNA3’末端的标记，连接单链。四、逆转录酶逆转录：以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。能将ATP上的y位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5’-OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5’端的5’-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。五、多聚核苷酸激酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸；常用于同种碱基多聚体接尾反应；核素标记DNA片段的3’端。六、末端脱氧核苷酰转移酶七、碱性磷酸酶（1）功能以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。（2）应用用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸，然后加上：γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端；用于避免单酶切后质粒自我环化。八、其他工具酶类（1）核酸酶BAL31从线形DNA分子两端(粘端/平端)以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核首酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。（2）外切核酸酶II能从线性DNA的3’-OH末端沿3’→5’方向切去单核首酸，制造3’端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。第二节基因克隆的载体一、载体的概念载体携带外源DNA进入宿主细胞的运载工具。它的本质是DNA复制子。AvehiclethatcarriesforeignDNAintoahostcellIt'sessentiallyaDNAreplicator载体是运载外源DNA进入宿主细胞的“车子”,即运载工具。vector运送外源基因高效转入受体细胞二、载体的功能为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的表达提供条件三、载体必须具备的基本条件具有合适的选择标记基因，最常用的标记基因是抗药性基因（抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素）等抗生素的抗性基因。具有合适的限制性内切酶位点，最好是单一的酶切位点且不在DNA复制必需区；能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制；三、载体必须具备的基本条件四、载体的分类及特性分类及特性2按照功能和用途分类1按照来源和性质分类

质粒载体病毒载体Cos载体克隆载体:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、细菌人工染色体、酵母人工染色体表达载体：原核表达载体和真核表达载体酵母人工染色体载体细菌人工染色体载体来源和性质附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子。是存在于细菌染色体以外的可以稳定遗传的共价、封闭、环状双链DNA分子。AsmallDNAmoleculeattachedtoanoncellularchromosomeornuclearDNAthatreplicatesautonomouslyItisacovalent,closed,circulardouble-strandedDNAmoleculethatexistsoutsidebacterialchromosomesandcanbeinheritedstably1质粒载体Plasmid质粒广泛存在于细菌细胞中，并不是细菌生长所必需的，大小从1～200kb不等，只有普通细菌核DNA的百分之一，是比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。1质粒载体1质粒载体质粒载体的特性：①自主复制性：根据质粒DNA复制与宿主之间的关系，可将质粒分为“严紧型”和“松弛型”。“严紧型”质粒通常只有1-3个拷贝，“松弛型”质粒一般有10-200个，目前使用的大多数质粒都属于“松弛型”；②不相容性：同一复制系统的不同质粒不能同时存在，这种特性称之为质粒的不相容性；③迁移性：非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能自我转移，但如果在其寄主细胞中存在着另一种接合型的质粒，那么他们通常也是可以转移的。1质粒载体（1）克隆载体的质粒应具备以下特点①分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；②具有1个以上的遗传标志，便于筛选；③具有多克隆位点。（2）广泛应用的质粒T质粒；pBR32质粒；pUC系列等。T质粒：pMD19-TpBR322质粒总长度为4363bp含有一个复制原点含有2种抗性选择标记基因：抗氨苄青霉素（AmpR）和四环素基因（TetR）具有多种单一酶切位点。此外，AmpR和TetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入；当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS)松弛型复制，拷贝数50~100/cellpBR322质粒pUC18/19质粒pUC质粒在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的LacZ基因，发展为具有双功能检测特性的新型质粒载体。特点①具有AmpR的抗性基因；②大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶α-肽链的DNA序列，并构成了lacZ’基因；③位点lacZ’基因中靠近5’-端的一段多克隆位点（WCS）区段。但该区段不会破坏该基因的功能。pUC18/19质粒pUC18/19质粒：

-互补实验正常pUC质粒转化大肠杆菌后，能够在含有Amp、X-gal以及诱导剂IPTG的培养基中正常生长，菌斑呈现蓝色。插入目的基因pUC质粒未重组成功的质粒转化大肠杆菌后，能够在含有Amp、X-gal以及诱导剂IPTG的培养基中正常生长，菌斑呈现蓝色。而重组成功的质粒则呈现白色。双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。2Cos载体组成特点特点：cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制;具有λ噬菌体的cos序列（12bp）和细菌质粒的复制原点，也具有抗生素抗性基因可接受长达50kb的外源DNA片段；用于基因作图分析。3λ噬菌体载体λ噬菌体基因组全长48502bp。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。λ噬菌体载体可接受15-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。4酵母人工染色体（YAC）属于穿梭载体，具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可以接受100~1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具。5细菌人工染色体（BAC）BAC载体是基于细菌的F因子的一些特点构建的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段的插入。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。

BAC载体本身分子量小，如pBeloBAC11载体，全长74kb且仅带有自我复制、控制拷贝数（repE

）及质粒分配（parE，parA,parB）所必须的最少序列。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。克隆载体用来保存、克隆和复制DNA片段的载体。表达载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。ExpressionvectorAvectordesignedtoenabletheinsertedforeignDNAtobeexpressedasapolypeptidechainiscalledanexpressionvector表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。表达载体表达载体分类原核表达载体繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定，基因克隆及表达系统成熟完善，全基因测序完成，被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。真核表达载体基因表达调控机理比较清楚，遗传操作方便，技术成熟，成本低廉，不含特异性病毒，不产生内毒素，安全性高。瞬时表达载体pBI221-GUS图谱原核表达载体图植物过表达载体酵母表达载体基因编辑载体第三节基因的分离一、未知功能基因的获得鸟枪法cDNA文库分离图位克隆法二、已知功能基因的获得1差异表达分析法2PCR扩增法3DNA合成法基因的分离一、未知功能基因的获得原理随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。局限性工作量大，需要了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；不能去除真核生物目的基因的内含子结构。1鸟枪法一、未知功能基因的获得referstoacollectionofclonedcDNAfragmentsformedbyreversetranscriptionofmRNAtranscribedatacertaindevelopmentalstageofanorganismandconnectedtoacarrier2cDNA文库分离法cDNA文库指某一生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆集合。Cdnalibrary特征cDNA文库具有时效性。文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该生物有机体的全部基因。基因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离分离出的基因还需进行序列测序、体外转录及翻译、功能互补实验等步骤一、未知功能基因的获得原理根据目的基因在染色体上的位置进行随机克隆。特点无需预先知道基因的序列无需预先知道基因的表达产物基于遗传图谱进行步骤3图位克隆法二、已知功能基因的获得原理根据2个基因组差异表达分离克隆目标基因。相关技术DDRT-PCR（差示技术）RDA（代表性差异分析）SSH（抑制性差减杂交）RSDD（交互式差减差异杂交）步骤1基因差异表达分析法二、已知功能基因的获得原理根据已知基因分离克隆目标基因。2PCR扩增法步骤步骤从GenBank寻找基因步骤设计引物步骤设计引物引物在结构组成上应满足以下条件：①引物长度在15～30个核苷酸，Tm接近72℃较佳（一般Tm=55℃～60℃）。

Tm值计算公式：Tm=(G+C)×4＋（A+T)×2②G+C碱基的含量在45％～55％左右。③引物中碱基的分布应该是随机的，避免出现一连串的单一碱基。④引物之间连续互补碱基也应小于4个。⑤两个引物在3’必须与模板互补，5’端可以不互补。⑥在引物5’端增加保护碱基。步骤设计合成与PCR扩增步骤电泳检测预测目标基因

目标基因的鉴定-PCR扩增扩增片段大小合适，对照没有条带步骤分析基因功能步骤转化验证基因是否表达二、已知功能基因的获得原理将欲合成的寡核苷酸链3’末端核苷以及3’-OH通过1个长的烷基臂与固相载体偶联。N1的5’-OH以二甲氧基三苯甲基保护。然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸链。方法磷酸三酯法；亚磷酸酯法；亚磷酸酰胺法；固相化技术。3DNA化学合成法DNA的化学合成研究始于20世纪50年代步骤第四节基因克隆策略及过程一、载体构架类型克隆载体的构建过程表达载体的构建过程二、载体构建步骤载体构建的整个过程可概括为五个步骤步骤“切、接、转、增、检”二、载体构建步骤从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（目的基因）和载体分子切开（简称“切”）。用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）。借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）。短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）。筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）。三、载体构建方法扩增产物两端带有特定的限制性内切酶位点；将目的基因连接到克隆载体中；转化Ecoli并筛选阳性重组子和测序。双酶切法三、载体构建方法同源重组法四、转化受体菌株大肠杆菌菌株：常用的有DH5α，Top10。此外还有JM109，XL1-Blue，Mach1-T1，DH10B。1克隆载体受体菌株农杆菌菌株：常用的有GV3101，LBA4404，EHA105。这些菌株适用于拟南芥、烟草、玉米、马铃薯等植物介导的转化。pGreen、pGreenII-62SK需要在GV3101（pSoup）中进行介导转化。2农杆菌菌株酵母菌菌株：常用的有Y187，Y1HGold，Y2HGold。此外还有AH109，P1518，NMY51，EGY48等。3酵母杂交菌株

1切基因片段的获得五、案例-克隆载体的构建过程——CBF2基因克隆

1切基因片段的获得五、案例-克隆载体的构建过程——CB