生物制药细胞工程单克隆抗体

EmilvonBehring,1901,

antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,

productionofantibodyNobelPrizewinners发明单克隆抗体技术NobelPrizein1984抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B細胞细胞工程杂交瘤技术鼠单抗人单抗大鼠小鼠产量高、操作比小鼠麻烦少用易操作、多用HAMA反应人人杂交瘤人B细胞、骨髓瘤细胞融合人鼠杂交瘤人B细胞、鼠骨髓瘤细胞融合杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定美国已上市16种单克隆抗体药物

2002年销售额29亿美元

2005年90亿美元我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。2002年完全人源化单抗humira获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。Avastin

是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的Fab段抗体药物。Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。抗血小板凝集的原理图抗体药物销售趋势图

全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体正在进行临床试验的抗体公司（38家）：AbgenixAlexionPharmAltarexAppliedMolecularEvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(CambridgeAbTech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson)ElanElsaiEliLillyGenzymeTransgenicsGenentechGenmabHoffman-LaRocheICOSPharmIDECPharm/MitsubishiImCloneSysImmunotechKaneboKnollPharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrthoBiotechPasteur-MerieuxProgenicsProteinDesignLabScheringSmithKlineBeechamTanoxBiosystemsTechnicloneXomaZenyakuTypeProductMarketerApprovedChimericRituxanNon-Hodgkin'slymphoma

Genentech

November1997

ChimericSimulectOrganrejectionprophylaxis

NovartisMay1998ChimericRemicadeRheumatoidarthritis,Crohn'sdiseaseohnson&JohnsonAugust1998CDR-graftedZenapax

OrganrejectionprophylaxisRocheDecember1997CDR-graftedSynagis

RespiratorysyncytialvirusMedimmuneJune1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedMylotarg

AcutemyeloidleukemiaAmericanHomeProductsMay2000MonoclonalAntibodiesontheMarket

TypeProductMarketerApprovedMurine

RadiolabeledZevalin

Non-Hodgkin'sLymphomaIDECPharmaceuticalsandScheringAGMarch2002PhageDisplayHumira

RheumatoidarthritisAbbottLaboratoriesDecember2002CDR-graftedXolair

ModeratetoseverepersistentasthmaGenentechandNovartisJune2003Murine

RadiolabeledBexxar

CD20positive,follicular,Non-Hodgkin'sLymphomaCorixaandGlaxoSmithKlineJune2003CDR-graftedRaptiva

Chronicmoderate-to-severepsoriasisGenentechandXomaOctober2003ChimericErbitux

ColorectalcancerImcloneandBristol-MyersSquibbFebruary2004CDR-grafted

Avastin（Bevacizumab）colonandrectumcancer

GenentechFebruary2004MonoclonalAntibodiesontheMarket

抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹研究 以免疫转印法检测

特定抗原医疗 以毒素连结抗体攻击

病变細胞检验 以ELISA侦测特定

病原体SDA批准进入临床的体内诊断用抗体

131I-抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1）

99mTc-抗人小细胞肺癌单克隆抗体（2F7）SDA批准进入临床的治疗用单抗抗T细胞免疫毒素抗C-ALL免疫毒素131I-抗肝癌单克隆抗体抗人CD25单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗流行性出血热抗体抗人CD3单克隆抗体抗人IL-8单克隆抗体抗体治疗疾病的机制抗原失活免疫效应细胞吞噬抗原表面弱化易受补体破坏单抗研发的演变历程鼠单抗100%鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人嵌合单抗(66-75%人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect人源化单抗(90-95%人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis100%人源抗体攻击病毒凝集细菌抗SARS的单抗SARS-CoV抗体生成技术Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一个抗原分子上可能有数个抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗体●蛋白质性

抗原決定基

含有六个以上氨基酸整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术

噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术1多克隆抗血清对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的

球蛋白条带缺失（c）。a1

a2bg白蛋白球蛋白（c）（a）（b）来源:

组织和细胞，其成分比较复杂。

1.组织和细胞成分混合抗原制备

2.蛋白质抗原制备

3.核酸抗原制备

4.类脂多糖抗原制备

5.免疫球蛋白片段制备

6.纯化抗原的鉴定

二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸可溶性抗原制备及鉴定返回

组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心

绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min

4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至

2～5%

细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养

37℃24h100℃水浴

2～2.5h

杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回杂交瘤技术过程多克隆抗体多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。

实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等副作用：

超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点：特异性差。多价抗原单克隆（致敏的B细胞）单克隆抗体单克隆抗体

传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反應交叉反应+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123可生产有用抗体的

淋巴細胞

若与

癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一個Bcell只产生一种抗体

●

一个

B细胞只能生产一种抗体，对付某一

抗原決定基。●

若有许多抗原決定基，则需许多株

B細胞分別生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开1234mmmm1234YYYYYYYYYm核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种

B細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集

B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原抗体的结构1小分子抗体3鼠单抗人源化基因工程改造的抗体2(1)小分子抗体123小分子抗体Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体

免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCL图5Fab抗体分子的制备IFabantibodymolecule抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1图5Fab抗体分子的制备IIFvantibodymolecule双特异性抗体抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B(2)抗体融合蛋白

抗原结合部位与生物活性蛋白结合

含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素

Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能G-CSFFcFusionProteinDNAligationexpressionFc的作用：延长血清中半寿期(3)鼠单抗人源化将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体●用抗体库技术进行人源化鼠单抗人源化Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗人改型抗体（CDR移植）

人源化抗体又称CDR移植抗体CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体图4鼠单克隆V区人源化（CDR移植）抗体库技术抗体库——在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)三基因工程方法研制新的单抗抗体库技术产生的三项技术基础

RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达噬菌体展示技术（phagedisplay)接头DNAVHVL图2噬菌体表面呈现的小分子抗体基因III或基因VIII外壳蛋白VHVL噬菌体抗体图示定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性噬菌体抗体库技术用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序噬菌体抗体库从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体（二）噬菌体抗体库技术的特点抗体库的构建抗体库的富集筛选13%21.7%52.3%13%

治疗性抗体的研发阶段靶标发现抗体制备抗体筛选、确认和优化中试工艺研究临床前研究临床研究主要研究进展靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他靶抗原的发现TRAIL:TNF-relatedapoptosis-inducedligandTRAILR:DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPGProteinextractionanddigestionTreated/SickControl/HealthyMassSpectrometerProteinpeptidesidentificationMSspectraquantificationcharacterizationKKYAAELHLVPOPhosphorylationKAVQQPDGLAOxidation…posttranslationalmodifications(PTM)QFHFHWGSLDQPDGLAPeptidesandMS/MSspectraHPLCProteomics20a5-6HeavyChainC5a新功能表位的确定20a5-6LightChain20a5-6Fab20a5-6Fab/C5a功能单抗识别表位可能是一个新的药靶？主要研究进展靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他治疗性抗体产生抗－抗体的比例抗体人源化的主要技术嵌合抗体CDR移植,FR移植,SDR移植表面氨基酸残基人源化抗原表位定向选择嵌合抗体、CDR移植抗体SDR人源化方法鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图表面氨基酸残基人源化鼠源抗体/抗原作用的复合物模型人源化抗体/抗原作用的复合物模型人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同抗原表位定向选择HL人抗体重链文库LHLLLLHLHLHHHH高亲和力人抗体抗原亲和筛选抗原亲和筛选+人抗体轻链文库人-鼠抗体库+鼠抗体人源抗体制备技术

人х人杂交瘤技术

EB病毒转化技术人源抗体库噬菌体抗体库合成抗体库核糖体展示抗体库转基因动物人源抗体的生产过程大容量抗体库107~8108~9抗体亲和力10-6~10-710-7~10-8109抗体库容>10910-8~10-9合成抗体库核糖体展示scFv文库各种抗体库筛选方法感染性筛选抗原库对抗体库筛选方法提高抗体特异性和亲和力Chainshuffling计算机模建技术定点突变技术chainshuffling原理示意图LHLLLLHLHLHHHHHL更高亲和力抗体亲和筛选建抗体库亲和筛选+重链文库建抗体库轻链文库高亲和力抗体+亲本抗体计算机模建预测抗体亲和力和识别表位HA2HA4HC4H22结合自由能分子间氢键识别区域表位是否漂移Z12-378.2-402.5-435.6-434.2-431.6182128383420-3223-30,70-8976-92136-147140-146是是是否抗体分子间氢键相互作用能（KJ）主要识别区域mCH2238-427.44136-149CH2236-425.37136-149抗体H22计算机分子设计与直接进化[S]-[B](10-11M)Ka~6x1010L/molB/F抗体CH22m亲和常数测定ItemsZ12Ka=8×107M-11/750CH22Ka=9×109M-11/6.5mCH22Ka=6×1010M-11Remicade®Ka=1×1010M-11/6Antibodyaffinity移植人免疫球蛋白的小鼠抗体结构信息具有重要的研究价值PDBView抗体结构分析抗体序列分析抗体表达分析抗体分类管理BLAST系统日志管理用户权限管理Kabat本地数据库抗体分类系统参数设置系统字典设置外部数据接口PDBGENEBANKSwiss-ProtTRRDKABAT本实验室抗体数据库抗体分析系统主界面抗体专家分析系统Her2靶点人源抗体（HF)的设计与验证Her2晶体结构D4SDS非还原电泳155KDaHF人源表达抗体的纯化和功能鉴定HF人源抗体基因合成、构建、表达人源化抗体设计、虚拟筛选抗体专家分析系统抗原抗体复合物结构信息分析HF人源抗体对Her2+

+细胞的ADCC杀伤效应分析HFSKVO3–Her2+++MCF7-Her2+HerceptinSKVO3–Her2+++MCF7-Her2+HF人源抗体对Her2靶点的特异性识别新抗体或抗体类似物的设计以抗原－抗体复合物的晶体结构设计新抗体以人抗体Fc为支架设计类抗体以全人抗体为支架设计小抗体以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子PT4－Linker－FC融合蛋白的构象

PT4-Linker-FC与TNF-α相互作用复合物的构象拮抗肽－linker－Fc融合蛋白设计抗体可变区框架作为支架VH结构域能够保持一定的刚性；

VH在空间上能够将几个短肽展示在一定的区域内；

抗体可变区骨架展示的外源肽段长度可以改变。

CDR3CDR1CDR2FR1FR2FR3FR4单域抗体（PTVH5）设计PTVH5与TNF形成的复合物模型单域抗体单链抗体(scFv)单链抗体（TSA1、TSA2）设计主要研究进展靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他提高抗体效应功能偶联细胞毒物质双特异性抗体抗体Fc突变改变抗体糖基化细胞内抗体抗体融合蛋白抗体药物的作用机理抗体偶联细胞毒物质TUMORCELL-S-S-Fab免疫毒素(植物和细菌)同位素(I131,I125,In111)抗体导向化学疗法（甲氨喋呤,长春新碱,阿霉素）裂解药物的酶抗体偶联细胞毒物质

-S-S-（链亲和素）免疫毒素（白喉毒素

蓖麻毒素

相思豆毒素）CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）抗体融合蛋白抗体融合蛋白

抗人Her2/neu单抗-IL-2

CTLA-4-Ig

抗纤维蛋白-ProUK抗活化血小板-UK双功能抗体作用原理BsAbBsAb效应细胞靶细胞触发受体膜表面分子NK细胞

CD16肿瘤细胞HER2/neu抗HER2/neu×抗CD16BsAbBsAb双特异性抗体介导的杀伤作用机制（a),BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b),连接的触发分子启动细胞毒反应；(c),效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。

细胞毒反应细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体细胞核EGFREGFREGFR目前细胞内抗体的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targetingsignals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。细胞内抗体细胞内抗体的作用机理阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白－蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。主要为：分子功能的研究下调生长因子受体的表达抑制细胞内癌蛋白的活性抑制病毒复制，如

抗HIV外壳蛋白

gp120抑制艾滋病毒复制

细胞内抗体广泛应用前存在的问题：基因转移系统的建立，特别是体内基因转移时基因的靶向传递的问题，使细胞内抗体基因导入充足数量的靶细胞中；细胞内抗体基因的持久表达及使细胞内抗体达到一定的浓度；细胞内抗体应无毒及不具免疫原性。鼠源性ScFv可引起人体发生细胞毒性T-细胞反应。应用人源性或人源化抗体可克服此问题。抗体的ADCC和CDC效应提高ADCC和CDC的策略抗体Fc突变改变抗体糖基化RituximabFc的三维结构Rituximab突变体与C1q的结合主要研究进展靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他提高表达量的方法应用扩增系统GS/DHFR弱化选择标记基因应用有利于基因表达的元件

强启动子强增强子反式作用元件位置效应（positioneffects)Cre-LoxP定点整合系统抗体的糖基化主要研究进展靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他抗体可变区和框架区的影响抗体稳定性可溶性折叠动力学表达PEG化的抗体或抗体片段重组多克隆抗体

重组多克隆抗体优点：可大量生产，批间稳定性好结合抗原的亲合力高