《基因工程的基本操作程序》课件

第2节基因工程的基本操作程序第3章内容索引0102课前篇自主预习课堂篇探究学习素养目标课前篇自主预习一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。(前提)2.基因表达载体的构建。(核心)3.将目的基因导入受体细胞。(关键)4.目的基因的检测与鉴定。(保证)二、目的基因的筛选与获取1.目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因,如与生物抗逆性、生物制药、毒物降解和工业用酶等相关的基因。2.筛选合适的目的基因(1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。(2)应用测序技术、序列数据库、序列比对工具等认知更多的基因结构和功能,以便找到合适的目的基因。3.获取目的基因的途径(1)人工合成目的基因。

基因库≠基因文库(2)构建基因文库获取目的基因。(3)PCR获取目的基因。

聚合酶链式反应4.利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的目的:在体外对目的基因的核酸序列进行大量复制。(2)PCR原理:DNA半保留复制。(3)PCR条件:一定的缓冲溶液、DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。分别与两条模板链结合,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸(4)每次循环的过程:变性→复性→延伸。①变性:当温度超过90℃时,双链DNA解聚为单链。

打开DNA双链②复性:冷却至50

℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸:加热至72℃左右时,4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(5)特点:上一轮循环的产物作为下一轮反应的模板,每一次循环后,目的基因的量可以增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,n为扩增循环的次数)。(6)鉴定:常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

①DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。

一般为1~5

V/cm

“同性相斥、异性相吸”②在琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。③凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。自我检测1.PCR是根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因进行大量复制的技术。判断下列有关PCR的表述是否正确。(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(

×

)(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(

√

)(3)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。(

×

)(4)PCR过程中需要模板DNA和一个引物分子。(

×

)2.(山东聊城高二期中)下列有关PCR技术的叙述,错误的是(

)A.PCR技术的原理是DNA半保留复制B.变性过程中破坏的是磷酸二酯键C.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的D.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等,无须添加ATP答案

B解析

PCR技术是利用DNA双链半保留复制,将基因的核苷酸序列不断地加以复制,使其数量呈指数方式增加,A项正确;变性过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链,破坏的是氢键,B项错误;引物是一段目的基因已知的核苷酸序列,复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的,C项正确;延伸过程中需要模板DNA、四种dNTP、耐高温的DNA聚合酶等,无须添加ATP,D项正确。

基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建1.基因表达载体构建的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成

3.基因表达载体的构建过程一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因,再用DNA连接酶把两者连接,形成一个重组DNA分子(如下图)。自我检测1.作为重组载体应具备的结构有目的基因、启动子、终止子、标记基因等。判断下列有关基因表达载体的表述是否正确。(1)表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。(

×

)(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子上游或终止子的下游才能进行表达。(

×

)(3)

基因表达载体中需要含有起始密码、终止密码、目的基因、标记基因。(

×

)(4)借助抗生素抗性基因可将含目的基因的受体细胞筛选出来。(

√

)2.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是(

)A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞中的mRNA反转录获得B.表达载体的复制开始于启动子C.胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用答案

C解析

由于人肝细胞中胰岛素基因不能表达,所以无法利用肝细胞中的mRNA反转录获得胰岛素基因,A项错误;表达载体的复制启动于复制原点,B项错误;胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间,C项正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,是转录的起点,而终止密码子位于mRNA上,在翻译中起作用,D项错误。四、将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞(1)农杆菌转化法。利用农杆菌细胞中Ti质粒上的T-DNA(可转移DNA)能够转移并整合到被侵染细胞的染色体DNA上的特点,将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,可以使目的基因进入植物细胞。

双子叶植物或礻果子植物(2)花粉管通道法。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②在植物受粉后的一段时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

表现全能性相对容易2.导入动物细胞(受精卵)显微注射技术。

大肠杆菌应用广泛3.导入微生物细胞用Ca2+处理细胞,使受体细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,再将重组的基因表达载体导入其中。

感受态细胞自我检测1.受体细胞不同,导入目的基因的方法不尽相同。判断下列有关将目的基因导入受体细胞的表述是否正确。(1)目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。(

√

)(2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(

×

)(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。(

×

)(4)生产需要加工和分泌的蛋白质时,酵母菌比大肠杆菌有优势。(

√

)2.(多选)下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时,从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法正确的是(

)A.图中Ⅰ是质粒,步骤①需要用到限制酶和DNA聚合酶B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒,步骤②是将重组质粒导入棉花细胞C.图中Ⅲ是农杆菌,通过步骤③将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达答案

CD解析

Ⅰ为质粒,步骤①为基因表达载体的构建,需要用到限制酶和DNA连接酶,A项错误;图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞,B项错误;图中步骤③是将目的基因导入植物细胞,C项正确;基因的表达具有一定的独立性,剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达,D项正确。五、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测

(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA。(3)检测目的基因是否翻译出相应蛋白质,通常用抗体进行抗原—抗体杂交。2.个体生物学水平的鉴定(1)通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。(2)通过相应病原微生物感染生物来确定相应抗病基因是否赋予了受体生物抗病特性以及抗性的程度。PCR等技术

自我检测1.要确定目的基因是否成功导入受体细胞,是否能稳定遗传并表达,需进行检测和鉴定工作。判断下列有关目的基因的检测与鉴定的表述是否正确。(1)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(

×

)(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(

√

)(3)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中,可用抗原—抗体杂交技术。(

×

)(4)抗虫、抗病鉴定可用于确定转基因生物是否具备相关性状。(

√

)2.实时荧光RT—PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT—PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(

)A.若检测结果有强烈荧光信号发出,说明被检测者没有感染病毒B.做RT—PCR之前,需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针C.需要将样本中的RNA逆转录为cDNA后再进行扩增D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体,其原理是抗原—抗体杂交答案

A解析

若检测结果有强烈荧光信号发出,说明被检测者体内有该病毒RNA,即被检测者感染病毒,A项错误;PCR需要根据目的基因的核苷酸序列合成引物,同时RT—PCR还需要探针与待测样本DNA混合,B项正确;PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板,所以需要将样本中的RNA逆转录为cDNA后再进行扩增,C项正确;RNA病毒的检测还可以通过特异性抗体检测,即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体,原理是抗原—抗体杂交,D项正确。课堂篇探究学习探究点一目的基因的筛选与获取[情境创设]

巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫,能够传播脑炎、丝虫等传染病,而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播,科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因,当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时,这种基因可以进入雌蚊的基因组,并使雌蚊死亡,从而达到减少该种蚊子的数量、抑制疾病传播的目的。1.该项研究的目的基因是什么?其作用是什么?提示

植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组,并使雌蚊死亡,从而减少该种蚊子的数量,抑制疾病传播。2.根据PCR获取和扩增目的基因的反应条件,完善表格。

条

件作

用在一定的缓冲液中进行提供相对稳定的

环境

合成DNA子链的原料DNA母链

催化合成DNA子链

与DNA母链相应互补序列结合,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸pH4种脱氧核苷酸提供DNA复制的模板耐高温的DNA聚合酶引物3.PCR反应的过程

过程说

明图

解

当温度超过90℃时,双链DNA

为单链

当温度下降到50℃左右时,两种引物通过

与两条单链DNA结合

变性解聚复性碱基互补配对过程说

明图

解

当温度上升到72℃左右时,耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始合成互补链,可使新链由

延伸5'端向3'端延伸[归纳提升]1.细胞内DNA复制与PCR技术的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解聚场所主要在细胞核内PCR扩增仪(PCR仪)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度,在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系(1)模板:均需要脱氧核苷酸单链作为模板(2)原料:均为4种脱氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成2种引物的作用

2.PCR反应中应注意的问题(1)PCR设计的引物长度一般为20~30个核苷酸,若引物太长会使扩增效率降低,而引物太短又容易导致异常DNA的产生。(2)PCR技术通过高温加热使双链DNA解旋,该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解聚为单链的现象称为DNA的变性,在降温时,双链可以重新形成,所以DNA的热变性是可逆的。

本质:氢键的断裂与形成(3)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度的设定主要与引物的长度和碱基组成中G—C比例呈正相关。如果复性温度太高,引物则无法与模板链结合,无法进行DNA复制,PCR反应也就得不到任何扩增产物。(4)DNA聚合酶从引物的3'端开始拼接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。3.目的基因的获取方法(1)PCR扩增。必须已知目的基因上的一段序列,以便设计引物。(2)人工合成。目的基因片段小,序列已知。(3)从基因文库中获取。目的基因序列未知。[探究应用]1.(山东师大附中高二期中)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述错误的是(

)A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入B.复性温度过高会导致引物不能与模板链牢固结合,PCR扩增效率下降C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2答案

D解析

引物中设计两种限制酶识别位点,可以配合载体的限制酶识别位点,帮助目的基因定向定点插入载体,避免发生自身环化,A项正确;PCR技术中,复性是指引物结合到互补DNA链,复性温度过高会引起碱基之间的氢键断裂,导致引物不能与互补DNA链(模板链)牢固结合,DNA扩增效率下降,B项正确;第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因,C项正确;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA只有1个,而子代DNA有23=8(个),故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8,D项错误。2.PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,利用该方法可以使目的基因迅速扩增,其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术的叙述,错误的是(

)A.PCR和体内DNA复制都需要模板、能量B.由PCR的反应过程可知,与氢键相比,磷酸二酯键对高温的稳定性更强C.PCR和体内DNA复制都需要4种脱氧核苷酸和2种引物D.PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板答案

C解析

PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量DNA为模板,复制出大量DNA,与体内DNA复制一样,都需要模板和能量,A项正确;由PCR的反应过程可知,高温使双链DNA解链,破坏的是碱基间的氢键,而没有破坏磷酸二酯键,则磷酸二酯键对高温的稳定性更强,B项正确;PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸,PCR是先解旋后复制出特定的DNA序列,需要2种引物,而细胞内DNA复制是边解旋边复制,则需要多种引物,C项错误;PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,继续合成子代DNA片段,D项正确。3.(多选)以下为逆转录过程和PCR扩增过程示意图。据图分析,下列说法正确的是(

)A.催化①过程的酶是逆转录酶B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合C.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%答案

ABC解析

由题意可知,①②③④⑤分别表示的过程是逆转录、DNA的复制、DNA解旋、引物结合到互补DNA链、DNA子链的合成,B项正确;①过程由逆转录酶催化完成,A项正确;催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶,C项正确;在DNA分子中有T无U,D项错误。探究点二基因表达载体的构建[情境创设]

游离的DNA进入细胞内,一般会直接被分解,就算可以进行转录、翻译成蛋白质,游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制,导致子代细胞中不再含有该游离DNA。若游离的DNA被整合到细胞的染色体DNA上,或以一种形式在细胞内独立稳定存在,能自我复制,则该游离DNA上的基因会随细胞分裂传递给子细胞或子代。1.通过PCR技术获取足够量的目的基因后,能直接导入受体细胞吗?为什么?提示

不能。若将目的基因直接导入受体细胞,目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制,不能稳定遗传和表达。2.基因表达载体的基本组成有哪几部分?提示

目的基因、启动子、终止子、标记基因等。3.标记基因的作用是什么?什么基因常用来作标记基因?提示

标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用抗性基因作为标记基因。4.培育转基因生物的核心工作是什么?构建基因表达载体的目的是什么?提示

培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的:(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代;(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。[归纳提升]1.构建基因表达载体时限制酶的选择技巧根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ;②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ;③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端;②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;③如果所选酶的切割位点不止一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能进行复制2.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别

项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质有特殊序列结构的DNA片段有特殊序列结构的DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录终止转录翻译的起始点终止翻译[探究应用]1.下面是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(

)A.图示过程是基因工程的核心步骤B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构答案

B解析

图示过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项正确;构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶Pst

Ⅰ、EcoR

Ⅰ,B项错误;抗卡那霉素基因是标记基因,目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞,C项正确;基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。易错提醒

基因表达载体易错点剖析(1)基因工程中的基因表达载体不等同于载体。基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的。目的基因应插入启动子和终止子之间的部位,若目的基因插入启动子部位,目的基因将无法表达。2.下列有关抗虫基因表达载体的叙述,正确的是(

)A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶B.抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因,其作用是筛选含有目的基因的受体细胞D.抗虫基因的表达启动于复制原点答案

C解析

切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶,只要切割出的切口末端相同即可,A项错误;抗虫基因表达载体必须具备启动子和终止子,终止密码子位于mRNA上,B项错误;基因表达载体必须具备标记基因,其作用是用于检测目的基因是否导入到受体细胞中,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来,C项正确;抗虫基因的表达开始于启动子,D项错误。3.图甲、乙中的箭头表示限制性内切核酸酶的酶切位点,AmP表示氨苄青霉素抗性基因,Neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(

)A.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后,含有4个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时,可用Pst

Ⅰ和BamHⅠ切割质粒和外源DNAC.用Pst

Ⅰ和HindⅢ切割质粒和外源DNA,可以保证重组DNA序列的唯一性D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长答案

C解析

图甲中的质粒用BamHⅠ切割后,获得一个DNA片段,其只含有2个游离的磷酸基团,A项错误;在构建重组质粒时,不能使用BamHⅠ切割外源DNA,因为用BamHⅠ会破坏目的基因的结构,但可以用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割质粒和外源DNA,B项错误;用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割质粒,切开的质粒由于两切口处黏性末端不同,不会自身连接,用这两种限制酶切割外源DNA,可得到目的基因的完整序列,且切口处黏性末端只能与切开的质粒的互补的黏性末端连接,保证了重组DNA序列的唯一性,C项正确;由于用PstⅠ切割质粒后,其中的氨苄青霉素抗性基因已被破坏,所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长,D项错误。探究点三将目的基因导入受体细胞[流程分析]

下图表示培育转基因抗病毒番茄的过程示意图。

1.简述用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程。提示

将目的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中,通过农杆菌对植物细胞的侵染作用,Ti质粒上的T-DNA转移至被侵染的植物细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。2.将目的基因导入植物细胞最常用的是哪种方法?简便经济的方法是哪种?我国科学家独创的方法是哪种?提示

农杆菌转化法最常用。除此之外还有花粉管通道法,这是一种更为简便经济的方法,也是我国科学家独创的方法。3.将目的基因导入动物细胞通常采用的方法是什么?选取的受体细胞一般是什么细胞?提示

显微注射法。受精卵。4.简述将目的基因导入大肠杆菌的基本过程。提示

用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。基因表达载体溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收基因表达载体。[归纳提升]1.受体细胞的选择(1)对于植物来说,受体细胞可以是受精卵或体细胞,因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说,受体细胞一般是受精卵,因为受精卵的全能性高,而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞,但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞,而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器),所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时,酵母菌比大肠杆菌有优势。2.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别

(1)图中a细胞减数分裂时,细胞质是不均分的,子细胞不一定含有目的基因。(2)图中b细胞在进行减数分裂时,细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中,保证了亲子代遗传性状的稳定性,细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。[探究应用]1.(多选)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程示意图。下列叙述正确的是(

)A.过程a需要限制酶和DNA连接酶的参与B.过程b需要用CaCl2处理,以提高农作物细胞细胞壁的通透性C.抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上,就能正常表达D.转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定答案

AD解析

题图中过程a为构建基因表达载体,需要用到限制酶和DNA连接酶,A项正确;CaCl2处理只是提高农杆菌细胞(原核细胞)细胞壁的通透性,B项错误;抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上不一定能表达,C项错误;转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒,观察农作物是否被感染来进行鉴定,D项正确。易错提醒

在将目的基因导入受体细胞之前,都必须进行基因表达载体的构建,也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子,而不是直接导入目的基因。2.受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的是(

)选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射法D水稻细胞农杆菌转化法答案

B解析

花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法,我国的转基因抗虫棉培育过程用到此种方法,A项正确;将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理法,这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B项错误;显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法,C项正确;可用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞,D项正确。3.农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物,是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达,该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是(

)A.可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物B.农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似C.使用农杆菌转化法时,目的基因应插入Ti质粒的T-DNA中D.合成新的T-DNA单链需要的DNA连接酶与限制酶,均在宿主细胞内合成答案

D解析

农杆菌易侵染双子叶植物和裸子植物,对单子叶植物没有侵染能力,原因是多数单子叶植物细胞不能合成酚类化合物,可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物,A项正确;农杆菌侵染宿主细胞后,能把它的T-DNA整合到植物细胞染色体的DNA上,其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似,都是基因重组,B项正确;使用农杆菌转化法时,T-DNA可将插入Ti质粒的T-DNA中的目的基因转移到植物细胞中,并能整合到染色体DNA上,C项正确;Ti质粒中的Vir基因区段在宿主细胞内的表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子,而合成新的T-DNA单链不需要限制酶,需要DNA聚合酶、DNA连接酶等,D项错误。探究点四目的基因的检测与鉴定[情境创设]

下图为抗虫棉的接种实验,结合图示(左图为转基因抗虫棉使虫体发育不正常)探究以下问题。1.分子水平的鉴定包括哪些内容?提示

目的基因的检测与鉴定在分子水平包括:目的基因是否插入受体DNA,目的基因是否转录出mRNA和目的基因是否翻译出蛋白质三个层次。2.观察下图,完善目的基因是否导入受体细胞,目的基因是否转录出mRNA的鉴定方法和原理。(1)由图可知,DNA分子杂交法的基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链,在一定条件下(适宜的温度等)按照

原则形成双链。杂交过程是高度特异性的,杂交的双方是

和用放射性同位素标记的

(又称基因探针)。若转基因生物的染色体DNA中有能与探针

的特异DNA片段,用于示踪的放射性同位素标记将指示其所在的位置,表明目的基因已插入到转基因生物

中。

(2)同理,利用DNA和mRNA之间分子杂交技术,检测目的基因是否

。

提示

(1)碱基互补配对待测的DNA已知DNA片段互补染色体的DNA

(2)转录出mRNA3.如何检测目的基因是否翻译成了蛋白质?提示

提取转基因生物的蛋白质,以相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若出现杂交带说明目的基因表达出相应蛋白质。也可进行个体生物学水平的鉴定。4.对于转基因抗虫或抗病植株,在个体生物学水平的鉴定包括哪些内容?提示

一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后,是否赋予了植物抗虫或抗病特性,在个体生物学水平上需要做抗虫或抗病的接种实验,以确定是否具有抗性以及抗性的程度。[归纳提升]1.目的基因的检测与鉴定2.不同分子检测原理的异同(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时,用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则,只是被检测的物质不同,一个是转基因生物的基因组DNA,一个是转基因生物细胞内的mRNA。(2)进行翻译水平的检测,通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,检测转基因生物的蛋白质,利用抗原与抗体特异性结合的原理。(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测,都是在体外进行的。[探究应用]1.(福建南平二模)植株在干旱、低温等逆境中,脱水素(具有一定抗干旱胁迫和耐冷冻能力的蛋白质)被诱导表达,脱水素基因编码区共含678个碱基对。科学家利用如图所示PBI121质粒,以及XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶,运用农杆菌转化法,将脱水素基因导入草莓试管苗叶片细胞,再经植物组织培养获得脱水素基因过量表达的转基因草莓植株。下列相关叙述,错误的是(

)A.重组质粒利用SacⅠ和HindⅢ切割后能得到1500bp片段,则表明目的基因正确插入质粒B.组织培养过程中,培养基需添加卡那霉素和新霉素以便筛选转基因植株C.可以利用PCR等技术鉴定目的基因是否整合到草莓染色体的DNA上D.转基因草莓植株批量生产前需进行抗干旱、耐冷冻实验答案

B解析

由于重组质粒上移除1

900

bp而补充了脱水素基因的678个碱基对,加上未移除的822

bp,所以用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后,可得到822+678=1

500(bp)的新片段,据此可确定目的基因正确插入了质粒,A项正确;题中提供的限制酶切割位点对卡那霉素抗性基因没有影响,所以无论是否插入了目的基因,卡那霉素抗性基因都可以表达,起不到筛选转基因植株的作用,B项错误;PCR技术是进行DNA扩增的技术,需要一段引物来进行扩增,依照脱水素基因的核酸序列设计一段引物,若能进行扩增,说明转入目的基因成功,C项正确;植株批量生产前,需要在个体水平上进行抗干旱、耐冷冻实验,以确保转基因植物中的脱水素基因表达出了蛋白质并发挥了作用,使植物表现为抗干旱、耐冷冻,D项正确。易错提醒

基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象;第一步筛选与获取目的基因,用人工合成、PCR获取或基因文库获取,三种常用方法都涉及碱基互补配对;第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体,第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA),也都存在碱基互补配对现象。2.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是(

)A.棉花细胞中检测到载体上的标记基因B.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因C.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNAD.酵母菌细胞中提取到人的干扰素答案

D解析

A、B两项只说明目的基因已导入受体细胞中,C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA。D项从酵母菌细胞中提取到了人的干扰素,说明目的基因完成表达。3.科学家将大麦细胞中的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的啤酒酵母菌可产生相应蛋白质,并酿出泡沫丰富的啤酒,其基本的操作过程如下图所示。请据图回答下列问题。(1)图中所示技术定向改变了啤酒酵母菌的性状,所利用的原理是

。

(2)本操作中为了将LTP1基因导入啤酒酵母菌细胞内,所用的载体是

。

(3)图中a、b过程使用到的酶分别是

。

(4)将LTP1基因导入啤酒酵母菌细胞中并成功表达,这里“成功表达”的含义是

。

答案

(1)基因重组(2)质粒(3)限制酶、DNA连接酶(4)啤酒酵母菌可产生相应蛋白质解析

(1)基因工程实现了不同种生物基因的重新组合,依据的原理是基因重组。(2)大肠杆菌细胞中的质粒是小型环状DNA分子,适于作为载体。分析题图可知,将目的基因导入啤酒酵母菌细胞使用的载体是质粒。(3)a过程中,用限制酶对含目的基因的DNA片段进行切割;b过程构建重组质粒,需用DNA连接酶连接目的基因和载体。(4)将LTP1基因导入啤酒酵母菌细胞并成功表达,这里“成功表达”的含义是LTP1基因在酵母菌细胞中通过转录和翻译合成了相应蛋白质。1234567891011121314A级必备知识基础练1.利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因。有关这一过程,下列说法错误的是(

)A.以含有目的基因的DNA片段作为模板B.目的基因的一段核苷酸序列已知,以便根据这一序列合成两种引物C.有足够的脱氧核苷酸作为原料D.加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增D1234567891011121314解析

用PCR技术扩增目的基因,应以含有目的基因的DNA片段作为模板,A项正确;PCR技术的前提条件是目的基因的一段核苷酸序列已知,以便合成一对引物,B项正确;DNA复制需要有足够的脱氧核苷酸作为原料,C项正确;PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶,不需要加入DNA连接酶,D项错误。12345678910111213142.对RNA病毒进行检测时可以采用实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法,RT-PCR的具体过程如图。下列叙述错误的是(

)A.过程①以mRNA为模板合成单链DNAB.过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上需要n个引物BC.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接D.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度B1234567891011121314解析

过程①是由mRNA形成单链DNA的过程,表示逆转录,A项正确;过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,根据DNA分子半保留复制特点可知,该过程理论上至少需要2n-1个引物B,B项错误;游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接,C项正确;利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度,是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),D项正确。12345678910111213143.PCR技术是在DNA聚合酶的作用下,在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是(

)A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链B.温度降低后,单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同C.以2条DNA单链为模板,以4种NTP为原料,经耐高温酶在高温下合成2个新的DNAD.设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次,DNA呈指数式扩增D1234567891011121314解析

双链DNA在高温下解旋即DNA双链打开,断裂的是碱基对之间的氢键,而磷酸二酯键没有断裂,A项错误;当温度降低时,引物与模板末端结合,单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补,B项错误;以2条DNA单链为模板,以4种dNTP为原料,在耐高温DNA聚合酶的作用下合成2个新的DNA,C项错误;PCR的反应步骤为目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在热稳定DNA聚合酶的作用下进行延伸,如此重复循环,因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍,即呈指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数),D项正确。12345678910111213144.关于基因表达载体构建的叙述,下列说法不正确的是(

)①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA

③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建都是完全相同的A.②③

B.①④C.①②

D.③④B1234567891011121314解析

基因表达载体的结构包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等,①错误;有了启动子才能驱动基因转录出mRNA,②正确;终止子的作用是使转录在所需要的地方停止,③正确;不同基因表达载体的构建不一定相同,④错误。12345678910111213145.在重组DNA技术中,将外源基因导入受体细胞,通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述,正确的是(

)A.质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子B.目的基因直接导入受体细胞则难以在受体细胞中表达C.目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达D.大多数天然质粒都不需要人工改造,可以直接作为载体使用B1234567891011121314解析

质粒是存在于许多细菌以及酵母菌(真核细胞)中的有自主复制能力的小型环状DNA分子,A项错误;载体中含有启动子、终止子等元件,可以调控目的基因的表达,因此必须构建基因表达载体,才能保证目的基因的表达,B项正确;目的基因无需整合到受体细胞的DNA中,只需要将含有目的基因的质粒导入受体细胞就能表达,C项错误;天然的质粒不能直接作为载体,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,D项错误。12345678910111213146.在基因工程的操作过程中,获得重组质粒不需要(

)①DNA连接酶②限制酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥四种脱氧核苷酸A.③⑥

B.②④C.①⑤

D.①②④A解析

构建重组质粒时,首先要用限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒,其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接;RNA聚合酶催化转录过程,获得重组质粒时不需要RNA聚合酶;获得重组质粒时,需要具有标记基因的质粒作为载体;重组质粒是由目的基因与质粒共同形成的;四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料,获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。12345678910111213147.某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,来表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因:A是抗链霉素基因,B是抗氨苄青霉素基因,且目的基因要插入基因B中,而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(

)A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒B.研究过程需要使用限制酶、DNA连接酶和载体这些专门的工具酶C.可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌D1234567891011121314解析

导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒,也可能为普通质粒,A项错误;构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶,载体不属于酶,B项错误;由于目的基因要插入基因B中,即抗氨苄青霉素基因被破坏,即工程菌不能抗氨苄青霉素,因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C项错误;重组质粒中抗氨苄青霉素基因被破坏,而抗链霉素基因完好,因此在含链霉素的培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌,D项正确。12345678910111213148.环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下,会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光,欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼,下列操作合理的是(

)A.将EEs基因的启动子与GFP基因重组B.将vtg基因的启动子与GFP基因重组C.将GFP基因的启动子与GFP基因重组D.将GFP基因的启动子与vtg基因重组B1234567891011121314解析

由题意可知,环境中的EEs可诱导斑马鱼体内vtg基因的表达,在不含EEs的环境中,斑马鱼体内vtg基因不能表达。因此,只要将vtg基因的启动子与GFP基因重组并导入斑马鱼体内,便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含EEs。12345678910111213149.DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子,将其导入人体内,在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答,且可持续一段时间。限制酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点如下图所示。下列分析正确的是(

)1234567891011121314A.构建DNA疫苗时,可用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoRⅠ切割质粒产生的DNA片段具有相同平末端C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA聚合酶连接,会产生多种连接产物D.抗原基因在体内表达时,需要经过转录和翻译过程,会发生氢键断裂和形成答案

D1234567891011121314解析

外源DNA分子和质粒上都含有3种限制酶(BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ)的切割位点,为了防止目的基因和载体的自身环化和两者之间的不定向连接,因此可用BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶进行切割,A项错误;EcoRⅠ切割后获得的是黏性末端,B项错误;用EcoRⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶连接,能产生多种连接产物,如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等产物,C项错误;抗原基因在体内表达时,需要经过转录和翻译过程,会发生氢键断裂(解旋)和形成,D项正确。123456789101112131410.请回答下列相关基因工程中构建基因表达载体的问题。(1)培育转基因植物过程的核心步骤是构建基因表达载体,其目的是使目的基因在受体细胞中

,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。

(2)构建基因表达载体时,可利用

酶连接被限制酶切开的

键。

(3)组成基因表达载体的单体是

。基因表达载体中的启动子是

识别和结合的部位,在结合完成后才能驱动目的基因通过

(填过程)合成mRNA。目的基因表达的翻译过程的终止信号是

。

稳定存在DNA连接磷酸二酯脱氧核苷酸RNA聚合酶转录终止密码子1234567891011121314解析

(1)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。(2)DNA连接酶的作用是在DNA片段之间形成磷酸二酯键。(3)基因表达载体的本质是DNA,其基本组成单位是脱氧核苷酸;基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,在结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA。目的基因表达的翻译过程的终止信号是终止密码子。1234567891011121314B级能力素养提升练11.像BclⅠ(5'-T↓GATCA-3')、BglⅡ(5'-A↓GATCT-3')、MboⅠ(5'-↓GATC-3')这样,识别序列不同、但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。下图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割,并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(

)1234567891011121314选项切割质粒切割目的基因结果分析ABclⅠ和BglⅡBclⅠ和BglⅡ形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同BBclⅠ和BglⅡMboⅠ切割后的质粒不可自身环化,切割后的目的基因可以自身环化CMboⅠBclⅠ和BglⅡ形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开,但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开DMboⅠMboⅠ切割后的质粒可以自身环化,切割后的目的基因也可以自身环化答案

B1234567891011121314解析

切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ,由于两种酶切割后产生的黏性末端相同,形成重组质粒时目的基因可能反向连接,形成的碱基排列顺序不一定相同,A项正确。切割质粒用BclⅠ和BglⅡ,切割后产生的黏性末端相同,切割后的质粒可能自身环化;切割目的基因用MboⅠ,切割后产生黏性末端,切割后的目的基因可以自身环化,B项错误。切割质粒用MboⅠ,产生黏性末端,切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ,产生黏性末端,形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变,不能再被这两种酶切割,但不影响MboⅠ的作用,C项正确。切割质粒用MboⅠ,切割目的基因用MboⅠ,产生的均为黏性末端,切割后的质粒可自身环化,切割后的目的基因也可以自身环化,D项正确。123456789101112131412.[多选]蜘蛛丝是天然蛋白纤维,其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维