ISO 20166-42021 分子体外诊断检查福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织的预检查过程规范第4部分原位检测技术标准立项发展报告

分子体外诊断检查福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织的预检查过程规范第4部分：原位检测技术标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpreexaminationprocessesforformalin-fixedandparaffin-embedded(FFPE)tissue—Part4:Insitudetectiontechniques摘要随着精准医学和个体化诊疗技术的快速发展，分子体外诊断在肿瘤病理学、药物伴随诊断及临床转化研究中的应用日益广泛。福尔马林固定和石蜡包埋（Formalin-FixedandParaffin-Embedded,FFPE）组织作为临床病理学中最常见的标本保存形式，其预检查过程的规范化程度直接影响下游分子检测结果的准确性和可重复性。然而，由于FFPE组织在固定、脱水、包埋及切片等环节中涉及的标准化流程长期缺乏统一的国际规范，不同实验室间的检测结果存在显著差异，严重制约了分子诊断技术在临床中的可靠应用。为应对上述挑战，国际标准化组织（ISO）于2021年7月正式发布ISO20166-4:2021标准，专门针对原位检测技术（insitudetectiontechniques）中FFPE组织的预检查过程提出了系统化的技术规范。本标准涵盖样本采集、固定、脱水、包埋、切片、抗原修复及原位杂交等关键环节的操作要求与质量控制指标，明确了各步骤中影响检测结果的关键参数及其验证方法。本报告系统分析了该标准的立项背景、研制历程、核心技术与指标内容，并对主要起草单位及相关标委会进行了介绍。报告认为，ISO20166-4:2021的发布填补了国际标准化体系中FFPE组织原位检测预检查过程的空白，对于提升分子病理检测质量、推动全球范围内检测结果互认以及促进精准医学的规范化发展具有里程碑式的重要意义。关键词：分子体外诊断；福尔马林固定石蜡包埋；预检查过程；原位检测；标准化；ISO20166-4Keywords:molecularinvitrodiagnostic;formalin-fixedandparaffin-embedded(FFPE)tissue;preexaminationprocess;insitudetection;standardization;ISO20166-4一、引言（一）研究背景与标准立项的必要性近年来，以荧光原位杂交（FISH）、显色原位杂交（CISH）、RNAscope等为代表的原位检测技术在肿瘤精准诊疗中发挥着不可替代的作用——从HER2基因扩增检测到ALK基因重排判读，从EB病毒编码RNA（EBER）检测到多种mRNA标志物的空间表达分析，原位检测技术以其能够在保留组织形态学信息的前提下实现核酸分子的定位与定量检测的独特优势，已广泛应用于临床病理诊断、治疗靶点筛选及预后评估等方面。然而，原位检测的可靠性和可重复性高度依赖于FFPE组织标本的质量。研究已充分证实，固定液的种类与浓度、固定时间的长短、脱水程序的设计、包埋温度的控制、切片厚度的均匀性、烤片温度与时长以及抗原修复方式的选择等预检查环节，均可能对组织中的核酸完整性和抗原可及性产生显著影响。实际操作中，不同实验室在上述环节的做法差异巨大，同一患者标本在不同实验室间常得出截然不同的检测结论。这种现状不仅对患者的诊疗决策构成潜在风险，也严重制约了多中心临床研究和跨地区病理会诊的开展。尽管ISO20166系列标准已就FFPE组织的核酸提取过程（第1部分）、形态学检测的组织切片制备过程（第2部分）以及DNA/RNA纯化过程（第3部分）等做出了规范，但对于原位检测技术的预检查操作尚缺乏系统化的国际标准指引——而原位检测恰恰对组织前处理提出了远比其他技术更为严格和精细的要求。因此，制定专门针对原位检测技术的FFPE组织预检查过程国际标准，既是弥补现有标准化体系的迫切需要，也是提升全球分子病理检测水平的关键举措。二、标准主要内容与技术要点（一）标准适用范围与定位ISO20166-4:2021明确规定，本标准适用于所有采用原位检测技术对FFPE组织样本进行分子体外诊断检查的医学实验室、研究机构及体外诊断试剂生产企业。标准涵盖从组织离体固定开始，至原位检测操作正式开始前的全部预检查步骤。需要特别指出的是，本标准主要面向人类临床样本的检测活动，但其所确立的技术原则和质量控制思想对动物组织样本及科研用途的FFPE样本同样具有重要参考价值。（二）关键技术指标与操作规范1.样本采集与固定环节标准对组织离体后的冷缺血时间（coldischemiatime）作出了明确规定，要求从组织离体到开始固定的时间间隔应尽量缩短，一般不应超过30分钟。同时，标准详细规定了固定液的种类选择（推荐使用10%中性缓冲福尔马林）、固定液体积与组织体积的比例（不少于10:1）、固定时间的最适范围（室温下6-24小时）以及固定温度的控制要求。值得强调的是，标准指出固定时间不足或过度固定均可导致原位杂交信号减弱或非特异性背景增高，因此实验室必须对固定过程实施严格的时间监控和记录。2.脱水、透明与浸蜡环节虽然该环节常被视为常规组织处理流程的一部分，但标准从原位检测的角度对脱水梯度、各梯度停留时间以及浸蜡温度（建议不超过60°C）和浸蜡时长进行了精细化规定。标准强调，过高的浸蜡温度或过长的浸蜡时间可能加剧核酸的降解和交联，降低原位杂交的检测灵敏度。3.切片与烤片环节标准建议FFPE组织切片的厚度应根据目标检测物的类型和丰度设定在3-5μm范围内，切片应保持完整、无皱褶、无刀痕。针对原位检测的特殊需求，标准对切片在载玻片上的黏附方式（推荐使用正电荷玻片或硅烷化玻片）、烤片温度（通常为60-70°C）及烤片时间（1-2小时）均提出了建议范围，以确保组织在后续的脱蜡、修复及杂交过程中能够稳定贴附，防止脱片。4.脱蜡与抗原修复环节脱蜡的彻底性是影响原位检测成败的关键因素之一。标准规定了脱蜡溶剂的选择、脱蜡的时间和温度、梯度乙醇水化流程等操作要素，并明确要求实验室应针对不同的脱蜡方式（如二甲苯脱蜡、环保型脱蜡液等）建立相应的验证数据。在抗原修复环节，标准认可热诱导抗原修复（HIER）和酶学修复两种主要方式，就修复液的pH值、温度、时间等关键参数提出了基本规范，并强调各实验室必须根据自身条件进行系统优化和验证。5.质量控制与性能验证要求标准设立了一整套质量控制体系，包括阳性和阴性对照的设置要求、组织的RNA/DNA完整性评估方法（如RNAscope检测中可采用看家基因探针评估RNA完整性）、检测灵敏度和特异性的定期验证频率以及外部质量评估（EQA）的参与要求。标准要求实验室应建立标准操作规程（SOP），并对预检查过程中的关键步骤实施记录留存，确保全程可追溯。三、标准研制历程简述ISO20166-4:2021的研制由ISO/TC212（临床实验室检验和体外诊断系统技术委员会）负责归口管理，具体由WG3“分子诊断学工作组”承担起草任务。在研制过程中，来自中国、德国、日本、美国、法国等多个国家的标准化专家和临床分子病理学专家深度参与。该标准历经工作组草案（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）等阶段，经过多轮技术论证、意见征集和投票修改，于2021年7月19日正式发布。该标准的研制充分参考了欧洲病理学会（ESP）、美国临床肿瘤学会（ASCO）以及美国病理学家学会（CAP）等相关专业组织发布的技术推荐文件，并兼顾了不同国家和地区实验室在技术条件、操作习惯和监管要求方面的差异，力求在先进性和普适性之间取得平衡。四、主要参与单位与标委会介绍ISO/TC212“临床实验室检验和体外诊断系统技术委员会”成立于1994年，是国际标准化组织下属专门从事临床实验室质量管理、参考系统及体外诊断产品标准化的技术委员会。其工作范围涵盖实验室质量管理体系、参考测量程序、质量控制材料、POCT设备及分子诊断等多个领域。TC212目前下设多个工作组（WG），其中WG3专注于分子诊断及核酸扩增相关标准化工作。TC212的秘书处设于美国国家标准学会（ANSI），其成员单位包括各国标准机构、国际专业学会及产业界代表。ISO20166-4:2021正是在TC212的组织框架下，联合WG3和各国镜像委员会历时多年协作的成果。在中国，中国合格评定国家认可委员会（CNAS）、中国食品药品检定研究院及相关标准化技术委员会积极参与了ISO/TC212的国际标准制定工作。国内多家大型三甲医院病理科和第三方医学检验机构相继依据ISO20166-4:2021建立了FFPE组织原位检测的预检查质量管理体系，有效推动了我国分子病理检测能力的提升。以中国医学科学院肿瘤医院病理科等为代表的国家级临床重点专科在推动标准在国内落地实施方面发挥了重要的示范引领作用。五、标准的意义与影响（一）对行业规范化发展的推动作用ISO20166-4:2021的发布从根本上结束了原位检测中FFPE组织预检查缺乏国际统一技术规范的历史。该标准以全面、系统和可操作的技术指标为全球范围内从事原位检测的实验室提供了明确的质量基准。对于体外诊断试剂生产厂家而言，该标准为产品验证和注册申报中的样本前处理要求提供了国际公认的技术依据；对于医学实验室而言，该标准为建立内部质量体系、设定性能验证方案以及参加能力验证活动提供了规范性文件；对于监管机构而言，该标准可作为审查实验室合规性和检测结果可靠性的技术参考。（二）对精准医学发展的支撑作用原位检测技术作为连接组织形态学与分子生物学的重要桥梁，其在伴随诊断、肿瘤分型及微环境分析中的应用正在持续扩展。ISO20166-4:2021通过规范预检查过程，最大化地减少了标本前处理环节引入的检测变异，为多中心临床试验数据的合并分析、跨区域病理会诊中的结果互认以及基于分子分型的个体化治疗决策提供了坚实的技术保障。该标准的确立也为未来将空间转录组学、多重免疫荧光等新兴原位检测技术纳入标准化体系奠定了框架基础。（三）国际影响与采纳情况自发布以来，ISO20166-4:2021已被多个国家和地区的标准化机构采纳为区域性或国家性标准，并被多家国际权威实验室认可项目和外部质量评估计划引用为技术依据。该标准目前已被美国临床实验室标准化协会（CLSI）及欧洲多家分子病理质量评估计划（如UKNEQAS）作为FFPE组织原位检测前处理环节的重要参考文件。六、结论与展望ISO20166-4:2021《分子体外诊断检查福尔马林固定和石蜡包埋（FFP