注射用曲妥珠单抗质量标准AS19990004

注射用曲妥珠单抗质量标准TrastuzumabJS20000014物理检查

冻干品为白色或淡黄色疏松体，溶解后为无色或淡黄色澄清或微乳光色溶液，不应有异物、浑浊或摇不散的沉淀。化学检查PH值

按《中国生物制品规程》（2000年版）附录《生物制品化学及其它检定方法》中的电位法测定，PH值应为6.0±0.6。克分子渗透压

按《中国药典》附录71方法测定，本品为干燥品，用注射用水溶解，应为60±15mOsm/kg。水分测定

用自动水分测定仪测定，含量应≤3%。纯度测定电泳法

按《中国生物制品规程》（2000年版）附录《生物制品化学及其它检定方法》中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，扫描后计算出免疫球蛋白含量，含量应达到95%以上。高压液相色谱法(IEC-HPLC法)

按《中国生物制品规程》附录《生物制品化学及其它检定方法》中的高压液相色谱法测定(IEC-HPLC法)，峰3≥55%（有效期内标准）。高压液相色谱法(SEC-HPLC法)

按《中国生物制品规程》（2000年版）附录《生物制品化学及其它检定方法》中的高压液相色谱法测定(SEC-HPLC法)，单体≥95%（有效期内标准）。蛋白质含量

按《中国生物制品规程》（2000年版）附录《生物制品化学及其它检定方法》中的蛋白质含量测定方法，含量应在440±35mg/瓶（440mg/20ml/瓶）。等电点测定

按《中国生物制品规程》（2000年版）附录《生物制品化学及其它检定方法》中的等电点测定方法，应与参比品一致。活性测定

BT-474法，抗体活性相对于参比品的相对效力值为80%～120%（方法见附录1）。无菌试验

按《中国生物制品规程》（2000年版）通则《生物制品无菌试验规程》测定，应为阴性。*交叉反应测定

用免疫组织化学方法测定，结果不应与人体组织器官发生交叉反应，与BT-474传代细胞瘤有特异性结合（方法见附录2）。内毒素测定

按《中国生物制品规程》（2000年版）通则《生物制品热内毒素试验规程》测定，不应大于36EU/瓶。异常毒性试验

按《中国生物制品规程》（2000年版）通则《生物制品异常毒性试验规程》，应合格。*CHO残留蛋白测定

按《中国生物制品规程》（2000年版）中的《重组人红细胞生成素制造及检定规程》3.1.10方法测定，其含量应〈0.1%。*外源性DNA残留量

按《中国生物制品规程》（2000年版）中的《重组人红细胞生成素制造及检定规程》3.1.9方法测定，DNA残留量应不高于100pg/剂量（440mg/20ml/瓶）【效期】3年【规格】440mg/瓶【生产国别及生产厂】美国Genentech有限公司【复核单位】中国药品生物制品检定所带*项目仅在进口注册或换证时进行检定，常规进口后不再进行。附录1Herceptin活性测定——BT-474抑制增殖试验实验材料: 96孔培养板 无菌注射水 rhuHER2现行参比品，15.5mg,-70C保存 BT-474检测培养液： DMEM:F12 50:50 89.8% FBS: 10% 庆大霉素，50mg/ml 0.2% ` 2-8C保存。 PBS:无菌，保存于2-8C。 胰酶+EDTA实验步骤：A：BT-474细胞的准备：移去细胞培养液，用5mlPBS洗涤。加入1ml胰酶，轻摇细胞瓶使其覆盖细胞，除去胰酶。加入1ml胰酶，轻摇，并放入培养箱中5-10分钟，镜下观察细胞脱落情况。取出培养瓶，拍5-6次，使细胞全部脱落。加10ml检测培养液混匀，用吸管吹打15-20次使细胞分散。将细胞悬液移到50ml离心管中计数计算所需细胞体积

C1=1105细胞/ml

V1=[(板数)6ml]+10ml备用

C2=细胞浓度

V2=现有细胞体积

V2=(C1V1)/C2将细胞（V2）加到检测培养液中，得到总的所需细胞体积（V1）。盖上盖，颠倒5-10次充分混匀，备用。B：标准及样品的准备标准曲线取出rhuMAbHER2参比品，配置成10mg/ml，保存于2-8C，备用。准备含有最高浓度、最低浓度及其它线性点的标准曲线。建议按以下方式稀释：管g/mg加样量加培养液量总体积A10000g/mla--B1000g/ml100l900l1000lC50g/ml50lB950l1000lD2g/ml50lC1200l1250lE1.00g/ml750lD750l1500lF0.70g/ml350lE150l500lG0.50g/ml250lE250l500lH0.30g/ml150lE350l500lI0.20g/ml105lE400l500lJ0.15g/ml75lE425l500lK0.10g/ml50lE450l500lL0.05g/ml25lE475l500lM(空白)0.0g/ml--500l500lA:每批参比品实际蛋白浓度。用D-M作为标准曲线。彻底混匀D。轻轻震荡B，C及E-I。样品：样品按以下方案稀释：管加样量加培养液量总体积A50l1200l1250lB40lA760l800lC40lB760l800lD100lC900l1000l用D作为样品。参比品按以下方案稀释：管加样量加培养液量总体积浓度A------1000g/mlB200lA800l1000lC100lB900l1000lD100lC900l1000lE100lD900l1000l用E作为样品。C:操作：加200l检测培养液于96孔板外周孔中。每板剩余60孔中各加100lBT-474细胞悬液。将培养板放于37C，含5%CO2培养箱中培养1-3小时。

注：不要振动板。准备标准品、样品及质控品，转入1ml无菌管中。按图1进行加样。5.1标准曲线及空白（10个浓度，每个浓度2孔）100l/孔；样品D和参比品E（一个稀释度，4孔）100l/孔；振荡3分钟，混匀。培养箱中培养5天（110-124小时）。镜下观察细胞生长状况。加25lalamar兰于每孔中。振荡3分钟。37C培养6-8小时。室温振荡培养10分钟。测定570nm和600nm下的读数。D： 结果分析计算A=A570-A600计算曲线的ED10和ED90：

ED10=[（m4-m1）0.9]+m1

ED90=[（m4-m1）0.1]+m1

m1=参比品蛋白浓度为0时的A（570-600）值；

m4=参比品蛋白浓度最高时（2g/ml）时A（570-600）值。绘制参比品A-蛋白浓度的逻辑模拟曲线（Logistic-fitting）；按下式计算样品相对于参比品的相对效力（RP）：

U=log10(RP)=1/b{log10(m1-Y样品)/（Y样品-m4）-log10(m1-Y参比品)/（Y参比品-m4）}

其中：b：为逻辑模拟曲线斜率。

RP=10U结果判定：

（1）当样品及参比品的4个A（570-600）中有一个以上超过ED10-ED90范围时，试验判为无效；计算均值时剔除超过ED10-ED90范围的数据。

（2）样品相对于参比品活性相对效力值（RP）应在80%-120%之间。E．结果分析方法-2：设U=In((m1-A)/(A-m4))，V=In(蛋白浓度X)将Y=((m1-m4)/(1+(X/ED50)**b))+m4转化为U=AV+B绘制U—A的线性标准曲线，获得A和B值，计算样品的U和V，并获得样品的活性浓度X值，样品的活性单位数为：U/mg，参比品的活性单位数为10000U/mg；C(U/mg)=(X*样品的稀释倍数*10-3*参比品的活性单位数*样品的总体积（ml）)/每瓶样品的重量（mg）=(X*106*样品的总体积（ml）)/每瓶样品的重量（mg）附录2单抗特异性、交叉反应免役组化检定材料和设备

37ºC温箱；显微镜实验步骤2.1实验前准备工作：正常人组织石蜡切片、胎儿组织石蜡切片、胎儿组织冰冻切片制备。免疫组织试剂盒、抗体、PBS缓冲液配制。2.2具体操作步骤：2.2.1切片脱蜡至水；3%双氧水室温孵育10-30分钟；蒸馏水洗，PBS浸泡5分钟；修复，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使温度保持在92至98度间并持续10-15分钟。取出容器，室温冷