T∕SAASS 339-2026 类胡萝卜素合成微生物底盘细胞构建与评价技术规程

ICS65.020.99CCSB43SAASSTechnicalcodeofpracticeforconstructionandevaluationofcarotenoid-synthesizingmicrobialchassisceIT/SAASS339—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省农业科学院提出。本文件由山东农学会归口。本文件起草单位：山东省农业科学院、山东佰萃生特殊医学用途配方食品有限公司、山东百沃生物科技有限公司、山东种业智科农业服务集团有限公司。本文件主要起草人：陈高、张樱馨、宣宁、耿耘、邵亚会、边斐、杨文龙、顾林林、刘金、赵红军、靳梦潇、王晓霞。1T/SAASS339—2026类胡萝卜素合成微生物底盘细胞构建与评价技术规程本文件规定了类胡萝卜素合成微生物底盘细胞的构建流程、遗传操作要求、性能评价指标及数据记录流程。本文件适用于利用酵母、大肠杆菌、蓝细菌和真核微藻等微生物底盘细胞进行类胡萝卜素生物合成的研究、开发与产业化应用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T31520红球藻中虾青素的测定液相色谱法GB/T37873合成基因质量评价通则GB/T41133番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝超高效液相色谱法GB/T44471-2024生物技术基本术语GH/T1386果蔬食品中叶黄素、玉米黄质、隐黄质和胡萝卜素的测定NY/T1736微生物肥料菌种鉴定技术规范SN/T2667-2010转基因微生物定性检测方法3术语和定义下列界定的术语和定义适用于本文件。3.1生物元件biologicalpart用来组装生物系统和分子机器的具有最基本生物功能的核酸或蛋白质序列。[来源：GB/T44471-2024，9.4]3.2宿主细胞hostcell被选定作为生物制造平台的基础和起点、未经工程化改造的原始微生物细胞。3.3底盘细胞chassiscell让设计的遗传程序在其中发挥作用的宿主细胞，具备清晰遗传背景，可通过生物元件组装进行代谢调控。[来源：GB/T44471-2024，9.9，有修改]3.4代谢流metabolicflux在特定环境条件下物质在代谢网络有关代谢途径中按一定规律进行生物代谢、转化和流动而形成的物质流。4宿主细胞选择4.1基因组要求所选宿主细胞宜具有清晰、明确的遗传背景，推荐使用已完成全基因组测序的菌株或藻株。2T/SAASS339—20264.2遗传操作要求选择宿主细胞时，应优先考虑具备成熟、可用的生物元件，能够将外源DNA高效导入细胞内，并使其以染色体整合或质粒复制的形式稳定维持的菌株或藻株。4.3工业适用性要求选择具有良好工业适用性的宿主细胞，具有适应性广泛、快速生长、耐受性强等特点，如：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）适用于脂溶性类胡萝卜素合成、大肠杆菌（Escherichiacoli）适用于水溶性衍生物合成、集胞藻PCC6803（Synechocystissp.PCC6803）和莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）适用于光合驱动型合成。5底盘细胞构建5.1宿主细胞准备5.1.1宿主细胞获取查询专业基因组数据库，获得目标菌株或藻株的保藏编号。应向专业的菌种或藻种保藏机构申请或购买，保证从正规渠道获取有质量保证的菌株或藻株。5.1.2宿主细胞鉴定细菌、真菌的鉴定按照NY/T1736执行。蓝细菌、真核微藻采用显微镜与分子鉴定方法相结合的手段进行鉴定：a)显微镜鉴定方法：利用光学显微镜获得蓝细菌、真核微藻的形态特征，与权威科学文献中的数据和描述进行比较，使用检索表进行鉴定；b)分子鉴定方法：蓝细菌进行16SrDNA序列分析，真核微藻进行18SrDNA或ITS序列分析。5.2生物合成途径设计解析目标产物的生物合成途径，以此为基础设计对宿主细胞自身类胡萝卜素生物合成途径的改造方案，通过基因克隆或合成手段，引入经密码子优化的关键异源基因（常见基因见附录A），优化代谢流提高类胡萝卜素前体物质供应，降低类胡萝卜素前体物质的旁路途径消耗。所有合成元件均需按照GB/T37873进行标准化质量评估。5.3基因表达载体构建5.3.1靶位点设计根据目标基因的表达水平和表达特性，对比全基因组序列，根据宿主基因的来源、载体启动子的种类、转录本数量、蛋白功能域等选择适合的软件设计宿主基因上的靶位点（常见启动子及选择标记见附录B）。5.3.2载体构建通过多基因共表达载体或染色体整合策略构建目标基因的表达载体。根据靶位点预测的结果，设计相应引物。根据基因组编辑的方式和对象选择适宜的载体，利用酶切连接或同源重组的方式将目标基因组装至表达单元中。5.4DNA转化方法5.4.1化学转化法5.4.1.1酿酒酵母：将使用醋酸锂处理获得的感受态细胞100μL、0.1μg～1μg质粒、变性的鲑精DNA与聚乙二醇/醋酸锂试剂混合，30℃孵育30min后，可加入DMSO并在42℃热激15min～20min，随即冰浴。最后离心涂布于营养缺陷型培养基，30℃培养2d～4d。3T/SAASS339—20265.4.1.2大肠杆菌：使用氯化钙处理获得感受态细胞，将100μL感受态细胞与1ng～100ng质粒DNA混合，冰浴30min后于42℃热激90s，冰浴冷却后加入LB培养基复苏45min～60min，最后涂布于抗性平板，37℃培养过夜。5.4.2自然转化法集胞藻PCC6803：收集培养至指数生长中期的细胞，加入0.5μg～5μg质粒DNA，在30℃,30μmolphotons/m²/s条件下孵育6h后涂布于无抗BG11平板，24h后转入抗性平板。用于同源重组的载体，其两侧同源臂的建议长度约为1000bp。5.4.3细菌接合转移鱼腥藻PCC7120：将含有接合质粒的大肠杆菌、含有运载质粒与辅助质粒的大肠杆菌1：1混合，混合菌液再与宿主细胞1：10混合，涂布于BG11抗性平板。5.4.4电转化法莱茵衣藻：收集指数生长期的细胞，使用含60mM山梨糖醇的TAP液体培养基洗涤并重悬后，将其与外源DNA混合，于无菌的4mm电击杯中，在电场强度0.6kV/cm～0.8kV/cm、脉冲时间约10ms的条件下进行电击。电击转化后，藻液连同电击杯在冰上静置10min，后转移至含60mM山梨糖醇的TAP液体培养基过夜恢复，随后使用相应选择标记进行筛选。5.5工程菌株的筛选和鉴定5.5.1工程菌株筛选基于选择性培养或报告基因筛选工程菌株，按照SN/T2667-2010中6.1和6.2执行。5.5.2工程菌株鉴定根据目标基因序列以及靶点位置，以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增目的片段，具体按照SN/T2667-2010中6.3执行。利用Sanger测序、下一代测序等方法准确检测工程菌株。进一步通过实时定量PCR和Western杂交等试验分析目标基因表达情况。6性能评价指标6.1生长性能6.1.1细胞密度野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株的细胞密度采用平板计数法或分光光度法测定，无法采用上述两种方法测量的丝状藻则采用显微镜计数法测定。6.1.2细胞干重野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株，离心收集菌体，经去离子水离心洗涤两次后，于105℃烘干48h，称重。6.1.3生长曲线野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株的生长曲线依据不同时间点的细胞密度绘制，针对不同物种，应设定差异化的监测策略，典型菌株的推荐培养基（见附录C）与实验参数为：a)酿酒酵母：采用YPD培养基，接种初始细胞密度OD600为0.1，培养温度30℃,转速150rpm，总时长24h～48h，间隔1.5h～2h；b)大肠杆菌：采用LB培养基，接种初始细胞密度OD600为0.1，培养温度37℃,转速200rpm，总时长12h～24h，间隔20min～30min；c)集胞藻PCC6803：采用BG11培养基，接种初始细胞密度OD730为0.1，培养温度30℃,转速150rpm，CO:通气量1%～3%，总时长7d～10d，间隔12h～24h；4T/SAASS339—2026d)莱茵衣藻：采用TPA培养基，接种初始细胞密度OD750为0.1，培养温度20℃,转速150rpm，CO2通气量1%～5%，总时长4d～6d，间隔12h～24h。6.1.4比生长速率在指数生长期，以恒定的时间间隔测量细胞密度，比生长速率(“)计算公式（1）如下：式中：t1、t2——两个取样时间点；X1、X2——在时间t1、t2测得的细胞密度。6.2.1野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株的番茄红素、叶黄素、玉米黄质、隐黄质、胡萝卜素的检测按照GB/T41133和GH/T1386的要求进行。6.2.2虾青素的检测按照GB/T31520的要求进行。6.2.3岩藻黄素采用高效液相色谱法检测。色谱条件为：RP-18色谱柱（4.6×250mm，5μm450nm检测，30℃柱温，以乙腈-甲醇-0.1%醋酸铵（75：15：10，体积比）为流动相，流速1mL/min。标品制备：精确配制360μg/mL标准母液，并稀释成7.20μg/mL～72.00μg/mL的梯度标准溶液，用于绘制标准曲线。6.3遗传稳定性在标准培养条件下，以固定接种比例，常用为1：100，连续传代10代以上，每代培养时间为宿主菌株的1个生长周期，培养温度为最适生长温度。每代检测目标基因保留率及类胡萝卜素产量稳定性。目标基因检测应显示通过qPCR或测序等方法确认目标基因拷贝数无显著下降，且关键功能区域无移码或无义突变；类胡萝卜素产量应无显著差异（t检验，显著性水平设为0.05）。7数据记录与报告应完整记录以下信息，确保所有记录真实、准确、清晰，并长期保存：a)宿主菌株来源、中文名、拉丁文名、编号；b)使用的质粒、基因序列及基因编辑工具；c)培养条件与发酵参数；d)检测方法与仪器型号；e)原始数据、质粒图谱及统计分析结果。5T/SAASS339—20268技术流程技术流程见图1。图1类胡萝卜素合成微生物底盘细胞构建与评价流程图9生物安全所有操作应符合GB19489的要求。6T/SAASS339—2026（资料性）常见类胡萝卜素生物合成途径中的基因及其编码的酶常见类胡萝卜素生物合成途径中的基因及其编码的酶见表A.1。表A.1常见类胡萝卜素生物合成途径中的基因及其编码的酶表Rhodobactercapsulatus、RubrivivaxgelatinosusErwiniauredovora、Syn是Fusariumoxysporum是R.sphaeroides、R.gelatinosus是Myxococcusxanthus、R.sphaeroides是S.elongatusPCC6301Synechococcussp.PCC79是ProchlorococcusmarinusMED4AtlantibacterhermanniiMarinobactersp.BSs20148Arabidopsisthaliana、Haematococcuspluvialis是Synechocystissp.PCC6803、A.thali是Synechococcussp.PCC79是是XanthophyllomycesdendrorhousH.pluvialis是E.herbicola、E.uredovoraE.uredovora是MycobacteriumintracellulareM.ulceransH.pluvialis、A.thaliana7T/SAASS339—2026（资料性）常见生物元件及其使用条件常见启动子及其诱导条件见表B.1。表B.1常见启动子及其诱导条件表psbA2,psbA3,6803无E.coliE.coliE.coliE.coliE.coli无无C.reinhardtii,PhaeodactylThalassiosirapseudonana无N.gaditana无N.gaditana无N.gaditana无N.gaditanaP.tricornutumP.tricornutum无P.tricornutumP.tricornutumP.tricornutum无P.tricornutumT.pseudonana常见选择标记及其选择条件见表B.2。表B.2常见选择标记及其选择条件表8T/SAASS339—2026ARG7NIT1URA5.3psbH类囊体膜蛋白（光系统II亚基）blmBnptIIblenat/sat1GATPDSPPOgusgfpglut1hup19T/SAASS339—2026（资料性）常用培养基配方YPD培养基的配方见表C.1。LB培养基的配方见表C.2。BG11培养基的配方见表C.3。微量元素溶液A5的配方见表C.4。