其它毒性第二军医大学新药评价中心新药评价

其它毒性试验第二军医大学新药评价中心·新药安全性评价系列课程Contents课程目录其它毒性评价方法与技术要点概述01刺激性试验评价02过敏性试验评价03溶血性试验评价04药物依赖性试验05免疫毒性试验与特殊毒性CHAPTER01刺激性试验评价血管刺激性、皮肤刺激性和眼刺激性的评价方法与技术要点IrritationTest·Overview刺激性试验概述与分类刺激性试验评价药物在接触部位产生的非免疫性可逆炎症反应，是注射剂、外用制剂和眼用制剂审评的核心环节。约15%的注射剂因刺激性问题被要求补充试验，直接影响新药研发进度。刺激性反应机制药物对接触组织产生的直接化学性损伤，表现为充血、水肿、渗出、变性和坏死等病理变化，与免疫介导的过敏反应机制不同直接化学性损伤血管刺激性试验适用于静脉、肌肉和皮下注射给药的新药，观察注射部位血管及周围组织的病理变化，评估药物对血管内皮和肌肉组织的损伤程度血管内皮损伤评估皮肤刺激性试验适用于经皮给药和外用制剂，采用Draize评分法对红斑和水肿进行量化评价，分为原发性和累积性刺激性两种试验类型Draize评分法眼刺激性试验适用于眼用制剂和可能接触眼部的药物，观察角膜、虹膜和结膜的损伤情况，采用改良Draize眼刺激性评分系统进行综合评价改良Draize系统VASCULARIRRITATION血管刺激性试验设计要点血管刺激性试验需模拟临床最高浓度和最快给药速度，采用同体左右自身对照设计，观察末次给药后48小时和恢复期2-4周的血管病理变化，确保评价结果能真实反映临床用药风险。01采用同体左右自身对照设计，一侧给予受试药物，对侧给予等容量溶媒作为对照，每侧至少注射3-7天以模拟临床连续给药方案02观察指标包括肉眼观察（红肿、硬结、血管充血）和组织病理学检查（内皮损伤、血栓形成、炎性浸润和坏死）03恢复期观察至关重要，末次给药后需继续饲养2-4周，再次取材做病理检查，判断血管和组织损伤是否具有可逆性不同给药途径血管刺激性试验参数给药途径推荐动物给药剂量给药天数静脉注射家兔/比格犬临床最大浓度3-7天肌肉注射家兔临床最大容量3-5天皮下注射大鼠/家兔临床最大容量5-7天椎管内注射家兔/犬临床等效剂量1-3天不同给药途径在动物选择、剂量设计和给药周期上存在显著差异，需根据临床实际用药方案个性化设计DermalToxicity皮肤刺激性试验与Draize评分法皮肤刺激性试验采用Draize评分法对红斑和水肿进行0-4分量化评价，需同时考察完整皮肤和破损皮肤的反应差异，以及单次给药与反复给药的累积刺激效应，为外用制剂的安全性评价提供依据。01Draize评分法对红斑（0＝无→4＝紫红色焦痂）和水肿（0＝无→4＝严重水肿）分别评分，总分8分判定刺激性等级02试验需设完整皮肤和破损皮肤两组，破损皮肤采用砂纸打磨或针刺法制备，比较两种状态下药物刺激性差异，模拟临床伤口用药场景03累积性刺激性试验连续给药14–21天，每日观察并记录皮肤反应变化趋势，特别关注停药后恢复情况，评价刺激反应的可逆性Draize皮肤刺激性评分标准反应类型0分2分4分红斑无红斑中度红斑紫红色焦痂水肿无水肿中度隆起严重水肿伴渗出刺激性判定0–0.4分无刺激2.1–6.0分中度刺激6.1–8.0分强刺激Draize评分法通过红斑和水肿两个维度对皮肤刺激性进行半定量评价，总分越高表示刺激性越强EyeIrritationTest眼刺激性试验评价方法眼刺激性试验采用改良Draize评分法对角膜（权重80分）、虹膜（权重10分）和结膜（权重20分）进行综合评价，需在给药后1小时至21天内多个时间点动态观察，角膜损伤程度是判定眼刺激性的核心指标。改良Draize评分体系角膜混浊程度（1-4分）与面积（1-4分）相乘再乘以5，最高80分；虹膜充血肿胀最高10分；结膜充血、水肿和分泌物各评分，最高20分。80分·角膜权重动态观察时间窗给药后1、24、48、72小时为必观察点，72小时内恢复则试验结束；仍有损伤则延长至7天、14天和21天持续观察，直至完全恢复或确认不可逆损伤。21天·最长观察期标准化试验操作使用白色家兔至少3只，给药侧结膜囊内滴入0.1ml受试物并轻闭眼睑1秒，对侧作为空白对照，确保评价结果具有组内可比性。≥3只·白色家兔辅助检测手段荧光素钠染色法可辅助检测角膜上皮微小损伤，裂隙灯检查可更精确地评估角膜混浊深度和前房反应，提高评价的敏感性和准确性。荧光素钠染色·辅助CaseStudies刺激性试验典型案例分析刺激性试验结果直接影响给药方案的制定和处方优化。血管刺激性超标可通过调整浓度、速度和溶媒改善；累积性皮肤刺激可通过限定贴敷时间控制风险，关键在于准确评估刺激反应的可逆性。静脉给药临床场景血管刺激性优化案例原处方在临床最大浓度下导致家兔耳缘静脉重度内皮损伤和血栓形成，血管刺激性评分达4级降低给药浓度30%、减慢输液速度至原速的1/2、添加0.1%利多卡因缓解疼痛，刺激性降至1级优化后静脉炎发生率从预计的25%降至3%以下，验证了临床前试验的预测价值皮肤累积刺激性案例连续贴敷7天后皮肤Draize评分达5.2分，属于中度刺激性停药3天降至0.8分，停药7天完全恢复至0分，证实刺激反应具有完全可逆性建议临床每贴使用不超过5天、间隔2天，有效控制了皮肤不良反应风险中药外用贴剂产品CHAPTER02过敏性试验评价全身主动过敏性试验（ASA）与皮肤过敏性试验（皮肤过敏）的方法与评价Immunotoxicology过敏反应机制与试验分类药物过敏反应按Gell-Coombs分类分为四型，新药评价重点关注Ⅰ型速发型和Ⅳ型迟发型，分别对应ASA与皮肤过敏性试验两种核心评价方法。Ⅰ型速发型超敏反应由IgE抗体介导，药物作为半抗原与载体蛋白结合后激活B细胞产生特异性IgE，再次接触时IgE与肥大细胞表面FcεRI受体交联，触发组胺等介质释放IgE·速发Ⅳ型迟发型超敏反应由T淋巴细胞介导，药物抗原经朗格汉斯细胞呈递给T细胞后激活致敏淋巴细胞，再次接触时引发以单核细胞浸润为主的炎症反应，通常在24-72小时后出现T细胞·24-72h全身主动过敏性试验（ASA）采用豚鼠模型，经致敏和激发两个阶段评价药物引发全身过敏反应的能力，观察呼吸困难、痉挛、休克甚至死亡等严重症状豚鼠·全身反应皮肤过敏性试验采用豚鼠模型，通过局部涂药致敏和激发，观察皮肤红斑、水肿等过敏反应，评价药物引发接触性皮炎的潜在风险豚鼠·接触性皮炎ASA·ActiveSystemicAnaphylaxis全身主动过敏性试验（ASA）操作流程ASA试验通过致敏-静息-激发三阶段设计，模拟药物引发Ⅰ型超敏反应的完整过程，是注射剂过敏性评价的金标准方法。01致敏期选用250-350g白色豚鼠，隔日腹腔注射受试药物0.5ml，共3-5次，使动物产生特异性IgE抗体02静息期末次致敏后间隔14-21天，免疫系统充分活化，IgE抗体水平达峰值，肥大细胞致敏完成03激发期静脉注射2倍致敏剂量受试药物，30分钟内观察抓鼻、喷嚏、呼吸困难、痉挛、休克等症状ASA全身过敏反应评价标准等级症状表现判定结果阴性（-）无任何过敏症状无过敏风险弱阳性（+）抓鼻、竖毛、不安轻度过敏阳性（++）喷嚏、咳嗽、呼吸急促中度过敏强阳性（+++）呼吸困难、痉挛、倒地严重过敏极强阳性（++++）休克、死亡致命过敏≥2只动物出现++级及以上反应判定为过敏阳性，需进一步研究致敏机制并采取风险控制措施SkinSensitization皮肤过敏性试验（GPMT法）GPMT法通过皮内注射联合局部涂药双重致敏，显著提高皮肤过敏检测灵敏度，特别适用于弱致敏性药物的检测。01三阶段致敏策略：第1天皮内注射受试物+完全弗氏佐剂；第7天局部封闭涂药48小时；第21天腹部去毛区激发涂药24小时。02激发后24和48小时观察腹部皮肤红斑与水肿，0-3分评分制：0=无反应，1=轻度红斑，2=中度红斑伴水肿，3=强红斑伴严重水肿。03致敏率=出现≥1分反应的动物数÷总数×100%。≥30%判定阳性（具有致敏性），<30%判定阴性。04较Buehler法灵敏度提高约2-3倍，但假阳性率相应升高，需结合两种方法结果综合判断。HypersensitivityTesting过敏性试验特殊问题与注意事项过敏性试验结果解读需警惕假阳性和假阴性。高渗或极端pH制剂可引起非特异性反应导致假阳性，需设溶媒对照；半抗原类药物在动物体内不能与蛋白充分结合可导致假阴性，需结合免疫原性数据综合评价。01生物制品（单克隆抗体、融合蛋白、重组蛋白）因具有固有免疫原性，ASA试验阳性率较高，需区分IgE介导的真正过敏反应与非特异性组胺释放引起的类过敏反应IgEvs类过敏02假阳性识别：高渗溶液（渗透压>600mOsm/kg）、极端pH（<4或>9）和含表面活性剂的制剂可引起非特异性肥大细胞脱颗粒，需通过溶媒对照和组织胺定量测定鉴别>600mOsm/kg03假阴性识别：小分子半抗原类药物（分子量<1000Da）在豚鼠体内可能无法与载体蛋白有效结合形成完全抗原，致敏失败时可考虑添加佐剂或采用PCA补充评价<1000Da04中药注射剂因成分复杂且含有大量大分子杂质（蛋白质、多糖、鞣质），过敏性试验阳性率显著高于化学药品，需在处方纯化工艺优化后重新评价大分子杂质CHAPTER03溶血性试验评价体外溶血试验方法、红细胞凝集观察与溶血机制分析InVitroHemolysisTest体外溶血试验方法与评价标准体外溶血试验通过分光光度法定量检测药物引起的红细胞溶血率，溶血率<5%为安全范围，>20%具有临床意义。试验方法取家兔抗凝全血2%悬液加入不同浓度受试药，37℃水浴孵育3小时，540nm测吸光度溶血率计算（受试药OD−阴性对照OD）÷（完全溶血OD−阴性对照OD）×100%，每浓度3管取均值红细胞凝集离心前肉眼观察凝集现象，红细胞聚集成团不易散开，可致微血管栓塞风险溶血动力学0.5、1、2、3、4小时取样检测，绘制时间-溶血曲线了解溶血速度特征判定标准溶血性评价判定标准溶血率判定等级临床意义<5%无溶血性注射剂血液安全性良好，可按临床浓度给药5%–20%轻度溶血需关注给药浓度和速度，建议临床缓慢滴注>20%显著溶血存在临床安全风险，需优化处方或改变给药途径伴有凝集凝集阳性红细胞凝集可致微血管栓塞，无论溶血率均需重视溶血率<5%为安全范围，>20%具有临床意义；红细胞凝集无论溶血率高低均需重点关注HEMATOLOGY·TOXICOLOGY溶血机制分析与影响因素药物溶血机制分为渗透压性、膜溶解性和氧化性三种类型，其中膜溶解性溶血最常见且最难解决。处方优化是降低溶血风险的核心策略。渗透压性溶血低渗溶液（<200mOsm/kg）导致水分大量进入红细胞使其膨胀破裂，可通过添加NaCl或葡萄糖调节至等渗（280-320mOsm/kg）完全避免。<200mOsm/kg膜溶解性溶血表面活性剂（聚山梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油）和有机溶剂（乙醇、PEG400）直接溶解红细胞膜脂质双分子层，是注射剂溶血的最常见原因。最常见原因氧化性溶血药物诱导红细胞内产生活性氧自由基，氧化血红蛋白形成海因茨小体并损伤膜骨架蛋白，常见于含醌类或硝基结构的药物。海因茨小体浓度-速度-时间溶血率与药物浓度、接触时间均呈正相关，临床可通过降低给药浓度、减慢滴注速度和增加血液稀释度来减轻溶血风险。三维调控HEMOLYSISCASESTUDY溶血性试验应用案例溶血性试验结果直接驱动处方优化决策。紫杉醇注射液通过从CremophorEL增溶改为脂质体制剂，溶血率从35%降至<2%；中药注射剂通过pH调整，溶血率从22%降至3%，体现了溶血试验在处方优化中的核心指导价值。紫杉醇注射液产品包装紫杉醇注射液处方优化01原处方含CremophorEL增溶剂，临床浓度溶血率35%伴红细胞凝集，存在严重血液安全风险02改用HP-β-CD包合技术溶血率降至8%无凝集，改用纳米脂质体制剂溶血率<2%无凝集03最终选择脂质体方案成功上市，临床溶血相关不良反应发生率降低90%以上中药注射剂pH优化01某中药注射剂在pH5.0条件下溶血率22%，属于显著溶血级别，需进行处方优化02系统考察pH4.0-8.0范围的溶血率变化，发现pH6.5-7.5区间溶血率均<5%03最终将处方pH调整至7.0±0.2，溶血率降至3%，同时保持了药物稳定性不受影响中药注射剂产品包装CHAPTER04药物依赖性试验身体依赖性与精神依赖性的动物模型评价方法与判定标准DEPENDENCE药物依赖性概念与分类药物依赖性分为身体依赖性（停药戒断综合征）和精神依赖性（强迫性觅药行为）两种类型。所有作用于中枢神经系统的新药均需进行依赖性筛查，评价策略为身体依赖性优先筛选、阳性后深入评价精神依赖性。01身体依赖性反复用药后机体产生适应性改变，突然停药或使用拮抗剂后出现戒断综合征，如阿片类药物停药后的打哈欠、流涕、震颤、腹泻等症状PhysicalDependence02精神依赖性药物激活中脑边缘多巴胺奖赏系统，产生欣快感或特殊心理体验，导致强迫性觅药行为，是药物滥用的核心驱动力PsychologicalDependence03需评价药物类别阿片类镇痛药、苯二氮卓类镇静催眠药、巴比妥类、中枢兴奋剂、大麻素类、NMDA受体拮抗剂等所有作用于CNS的药物CNS作用药物04级联评价策略首先通过自然戒断试验和催促戒断试验筛查身体依赖性，阳性药物进一步通过自身给药试验和条件位置偏好试验评价精神依赖性潜力筛查→深入评价DEPENDENCEASSESSMENT身体依赖性试验方法身体依赖性评价采用自然戒断和催促戒断两种方法。自然戒断法连续给药14-30天后突然停药观察72小时戒断症状，催促戒断法注射特异性拮抗剂加速戒断出现，后者灵敏度更高，适用于弱依赖性药物的检测。自然戒断试验01连续给药14-30天（递增或固定剂量），使动物建立稳定药物依赖状态02突然停药后连续观察72小时，记录体重、体温及行为学戒断症状03改良Gellert-Holtzman评分，总分≥30判定为具有身体依赖性潜力72h催促戒断试验01给药7-14天建立依赖后，注射纳洛酮（0.5-10mg/kgip）催促戒断0230分钟内密集观察，典型表现含跳跃反应、腹泻和体温下降03灵敏度较自然戒断提高3-5倍，周期缩短50%以上，弱依赖首选3-5×DEPENDENCEEVALUATION精神依赖性试验方法精神依赖性评价以自身给药试验为金标准，动物主动按压杠杆获取药物的次数反映药物正性强化效应；条件位置偏好试验（CPP）通过动物对给药侧的偏好程度评价药物奖赏效应，两种方法互补验证药物的精神依赖性潜力。自身给药试验大鼠或猴静脉插管后置于操作箱，按压有效杠杆可获得药物注射（FR1程序），连续训练14天，有效杠杆按压次数显著高于生理盐水对照提示正性强化效应。该方法是评价精神依赖性的金标准，直接反映药物的奖赏特性。FR1·14天进阶程序递进比率（PR）程序测量断裂点，断裂点越高说明药物动机越强；以及reinstatement模型评价药物复吸风险。进阶程序可进一步区分不同药物的奖赏强度，为临床用药风险评估提供量化依据。PR·Breakpoint条件位置偏好（CPP）将实验箱分为黑白两侧，给药日在黑侧给药、对照日在白侧给溶媒，训练8-10天后测试动物在两侧停留时间，黑侧增加>100秒判定为CPP阳性。该试验操作简便，无需手术植入，是筛选药物奖赏效应的常用方法。>100s·8-10天药物辨别刺激试验训练动物辨别药物状态和生理盐水状态，在药物状态下按压一个杠杆获取食物、在溶媒状态下按压另一个杠杆，测试时观察新药物能否替代训练药物的辨别刺激。该试验可评价药物的主观效应特征，预测临床滥用潜力。DrugDiscriminationDrugDependenceEvaluation药物依赖性试验完整评价体系药物依赖性评价采用"身体依赖性筛查+精神依赖性确认"的级联策略。自然戒断和催促戒断试验用于身体依赖性筛查，自身给药和CPP试验用于精神依赖性确认，各试验方法在灵敏度、周期和成本上各有优劣。药物依赖性试验方法对比试验方法评价类型主要优势试验周期自然戒断试验身体依赖直接观察戒断症状全貌，评价客观21-37天催促戒断试验身体依赖灵敏度高，周期短，适合弱依赖药物10-18天自身给药试验精神依赖金标准，直接测量正性强化效应30-60天CPP试验精神依赖操作简便，不需手术，适合初筛14-20天药物辨别试验精神依赖可评价主观效应相似性，分类学价值高60-120天身体依赖性试验周期较短（10-37天），精神依赖性试验周期较长（14-120天），需根据药物类别和审评要求合理组合CHAPTER05免疫毒性试验与特殊毒性免疫抑制与免疫刺激毒性评价、光毒性试验及其他特殊毒性项目IMMUNOTOXICITY免疫毒性分类与分级评价策略免疫毒性分为免疫抑制与免疫刺激两类。ICHS8推荐分级评价：Tier1常规筛查免疫指标，异常时进入Tier2深入评价。免疫抑制毒性表现胸腺和脾脏萎缩、外周血淋巴细胞计数下降、IgG/IgM水平降低、对感染的易感性增加、肿瘤发生率升高Suppression·抗感染↓抗肿瘤↓免疫刺激毒性表现自身抗体产生、免疫复合物沉积、血清病样反应、细胞因子风暴、超敏反应发生率升高Stimulation·自身免疫↑超敏↑Tier1筛查指标血液学（白细胞分类计数）、血清免疫球蛋白水平、免疫器官重量和组织病理学、淋巴组织形态学观察Tier1·常规重复给药试验Tier2深入评价T细胞依赖性抗体应答（TDAR）、NK细胞活性测定、淋巴细胞亚群流式分析、巨噬细胞功能测定、细胞因子谱分析Tier2·Tier1异常时追加IMMUNOTOXICOLOGY·TIER2Tier2免疫毒性核心试验方法TDAR试验（SRBC免疫法）是免疫功能综合评价的金标准，两者结合可全面反映药物对适应性免疫和固有免疫的影响。01TDAR操作流程：第21天腹腔注射SRBC（1×10⁸个/只）免疫，第25-28天采集血清，用ELISA法或空斑形成细胞（PFC）法测定抗SRBC特异性IgM和IgG抗体滴度02TDAR结果判定：抗体滴度较对照组下降≥50%判定为免疫抑制阳性，下降20-50%为可疑阳性需进一步验证03NK细胞活性测定：以YAC-1淋巴瘤细胞为靶细胞，效应细胞与靶细胞按50:1、25:1、12.5:1比例共培养4小时，用LDH释放法或⁵¹Cr释放法计算杀伤率04淋巴细胞亚群分析：流式细胞术检测外周血和脾脏中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T/B/NK细胞比例和绝对计数，计算CD4/CD8比值流式细胞仪实验室设备Phototoxicity&Photoallergy光毒性与光过敏性试验光安全性评价针对紫外吸收药物（290-700nm，摩尔消光系数>1000L/mol/cm），光毒性为药物光化学反应直接损伤皮肤，光过敏性为光抗原激活免疫应答。体外3T3-NRU光毒性试验是首选筛查方法，PIF≥5判定为光毒性阳性。01光毒性机制药物分子吸收UVA/UVB光子后从基态跃迁至激发态，通过Ⅰ型（自由基）或Ⅱ型（单线态氧）光化学反应损伤细胞膜、DNA和蛋白质。Ⅰ/Ⅱ型光化学反应02光过敏性机制药物在紫外线照射下发生光化学变化形成光半抗原，与皮肤蛋白结合后形成完全抗原，激活T细胞介导的Ⅳ型迟发型超敏反应。Ⅳ型迟发型超敏反应03体外3T3-NRU试验小鼠3T3成纤维细胞在有无UVA照射（5J/cm²）条件下检测药物细胞毒性，计算光刺激因子PIF=IC50(−UV)/IC50(+UV)。OECD432·PIF04判定标准PIF<2无光毒性；2≤PIF<5可能光毒性需体内验证；PIF≥5光毒性阳性。体内验证采用豚鼠或无毛小鼠耳肿胀模型。PIF≥5ICHS2(R1)·GenotoxicityBattery遗传毒性试验标准组合ICHS2(R1)推荐的遗传毒性标准组合包含三项核心试验：Ames试验检测基因突变、体外染色体畸变试验检测结构畸变、体内微核试验检测体内染色体损伤。三项全阴性可基本排除遗传毒性风险，任一阳性需追加试验深入评估。Ames试验细菌回复突变试验，使用TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA102五菌株，在±S9条件下检测点突变和移码突变GeneMutation体外染色体畸变CHL/V79或人外周血淋巴细胞，±S9条件下检测染色体结构畸变（断裂、交换、缺失）和数目畸变Chromosome体内微核试验小鼠或大鼠给药后采集骨髓或外周血，计数嗜多染红细胞微核率，评价染色体断裂和纺锤体损伤InVivo追加试验标准组合阳性时可选用彗星试验、γH2AX焦点法、Pig-a基因突变试验，评估体内相关性和靶器官特异性Follow-upREPRODUCTIVETOXICITY生殖毒性试验概述生殖毒性评价覆盖从配子形成到子代性成熟的完整生殖周期，ICHS5(R3)推荐三段试验方案。Ⅰ段评价生育力、Ⅱ段评价致畸性、Ⅲ段评价围产期影响，三者共同构成新药生殖安全性的完整评价体系。三段试验方案Ⅰ段生育力与早期胚胎发育雌雄大鼠交配前至着床期给药，评价配子成熟、交配行为、受精和着床能力Ⅱ段胚胎-胎仔发育妊娠第6-15天给药（器官形成期），评价胚胎致死性和致畸性，是传统致畸试验Ⅲ段围产期发育妊娠第15天至哺乳结束给药，评价胎儿晚期发育、分娩和子代出生后发育至性成熟替代方法进展增强型围产期发育毒性试验ePPND将Ⅰ段和Ⅲ段合并，减少约30%的动物使用量，同时获得更完整的生殖周期数据动物福利数据整合体外替代筛选方法体外全胚胎培养（WEC）和胚胎干细胞试验（EST）作为致畸性初筛替代方法，已被ECVAM验证WECESTECVAM验证特殊毒性评价致癌性试验概述致癌性试验是周期最长（104周）、成本最高的特殊毒性项目，适用于长期用药或具有潜在致癌风险的药物。转基因小鼠模型可将周期缩短至26周。启动指征临床连续用药超过6个月、间歇用药治疗慢性疾病、已有遗传毒性或促增殖信号、药物结构与已知致癌物相似>6个月标准方案大鼠和小鼠双种属，每组≥50只/性别/剂量组，设3个剂量组加1个对照组，终点指标为肿瘤发生率和类型104周剂量选择高剂量采用最大耐受剂量或AUC达临床暴露量25倍、或2000mg/kg/day限量剂量，中低剂量按等比递减×25AUC替代方案Tg.rasH2转基因小鼠26周试验可替代小鼠104周试验，p53+/-小鼠用于检测基因毒性致癌物−60%成本SAFETYSTRATEGY新药安全性评价整体策略基础、局部、特殊毒性试验协同互补，构成新药安全性评价完整画像。局部安全性评价刺激性试验评价给药部位直接损伤