ISO 188622025 咖啡和咖啡制品 丙烯酰胺的测定 衍生化后使用高效液相色谱串联质谱检测(HPLC-MSMS)和气相色谱质谱检测(GC-MS)的方法标准立项发展报告

咖啡和咖啡制品丙烯酰胺的测定衍生化后使用高效液相色谱串联质谱检测（HPLC-MS/MS）和气相色谱质谱检测（GC-MS）的方法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Coffeeandcoffeeproducts—Determinationofacrylamide—Methodsusinghigh-performanceliquidchromatographywithtandemmassspectrometricdetection(HPLC-MS/MS)andgaschromatographywithmassspectrometricdetection(GC-MS)afterderivatization摘要丙烯酰胺是食品在高温加工过程中（如烘焙、油炸等）由还原糖与天冬酰胺发生美拉德反应而产生的一种潜在致癌物。咖啡作为全球消费量最大的嗜好性饮品之一，其烘焙工艺决定了咖啡制品中不可避免地会产生丙烯酰胺。2015年欧洲食品安全局（EFSA）发布的科学意见进一步确认了丙烯酰胺的潜在健康风险，促使欧盟于2017年首次制定了食品中丙烯酰胺的限量基准水平，咖啡及咖啡代用品位列其中。在此背景下，建立准确、灵敏、可靠的丙烯酰胺检测方法，成为全球食品安全监管和国际贸易中的关键技术需求。国际标准化组织（ISO）于2025年11月27日正式发布ISO18862:2025《咖啡和咖啡制品丙烯酰胺的测定衍生化后使用高效液相色谱串联质谱检测（HPLC-MS/MS）和气相色谱质谱检测（GC-MS）的方法》。该标准规定了采用衍生化结合高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和气相色谱-质谱法（GC-MS）测定咖啡及咖啡制品中丙烯酰胺含量的方法原理、试剂与材料、仪器设备、样品前处理、色谱质谱分析条件、定量校准、精密度及质量保证与控制等技术要求。该标准的发布填补了国际标准化组织在咖啡制品中丙烯酰胺检测方法领域的空白，为全球咖啡贸易中的质量安全监控提供了统一、可靠的技术依据。本报告系统梳理了该标准的立项背景、研制历程、核心技术内容及预期应用前景，以期为相关标准化工作者和食品检测技术人员提供参考。关键词：丙烯酰胺；咖啡；高效液相色谱-串联质谱；气相色谱-质谱；衍生化；食品安全；国际标准AbstractAcrylamideisapotentialcarcinogenformedinheat-processedfoods(suchasroasting,frying,etc.)throughtheMaillardreactionbetweenreducingsugarsandasparagine.Asoneofthemostwidelyconsumedbeverageproductsglobally,coffeeinevitablycontainsacrylamideduetoitsroastingprocess.In2015,theEuropeanFoodSafetyAuthority(EFSA)publishedascientificopinionfurtherconfirmingthepotentialhealthrisksofacrylamide,promptingtheEuropeanUniontoestablishthefirstbenchmarklevelsforacrylamideinfoodin2017,withcoffeeandcoffeesubstitutesincluded.Againstthisbackground,establishingaccurate,sensitiveandreliableanalyticalmethodsforacrylamidehasbecomeacriticaltechnicalrequirementinglobalfoodsafetyregulationandinternationaltrade.TheInternationalOrganizationforStandardization(ISO)officiallypublishedISO18862:2025"Coffeeandcoffeeproducts—Determinationofacrylamide—Methodsusinghigh-performanceliquidchromatographywithtandemmassspectrometricdetection(HPLC-MS/MS)andgaschromatographywithmassspectrometricdetection(GC-MS)afterderivatization"onNovember27,2025.Thisstandardspecifiesthemethodprinciples,reagentsandmaterials,instrumentsandequipment,samplepreparation,chromatographicandmassspectrometricconditions,quantification,precision,andqualityassuranceandcontrolrequirementsforthedeterminationofacrylamideincoffeeandcoffeeproductsusingderivatizationcoupledwithHPLC-MS/MSandGC-MS.Thepublicationofthisstandardfillsthegapinthefieldofanalyticalmethodsforacrylamideincoffeeproductswithintheinternationalstandardizationsystem,providingaunifiedandreliabletechnicalbasisforqualityandsafetymonitoringinglobalcoffeetrade.Thisreportsystematicallyreviewstheprojectbackground,developmentprocess,coretechnicalcontent,andanticipatedapplicationprospectsofthisstandard,aimingtoprovidereferenceforstandardizationprofessionalsandfoodtestingpersonnel.Keywords:Acrylamide;Coffee;HPLC-MS/MS;GC-MS;Derivatization;Foodsafety;Internationalstandard一、引言1.1丙烯酰胺的食品健康风险与监管背景丙烯酰胺（Acrylamide，CASNo.79-06-1）是一种白色结晶性有机化合物，分子量为71.08，具有高水溶性和热稳定性。2002年，瑞典斯德哥尔摩大学联合瑞典国家食品管理局首次报道了在富含碳水化合物的热加工食品中检出较高含量的丙烯酰胺，这一发现引起了全球食品安全领域的广泛关注。后续研究表明，丙烯酰胺主要是在食品加热温度超过120℃的条件下，由游离天冬酰胺与还原糖（如葡萄糖、果糖）通过美拉德反应途径生成。国际癌症研究机构（IARC）将丙烯酰胺归类为2A类致癌物（对人类很可能致癌），表明其对实验动物具有明确的致癌性，对人类具有潜在的致癌风险。丙烯酰胺在食品中的暴露评估显示，咖啡及其代用品是成年人膳食丙烯酰胺摄入的重要来源之一，仅次于薯条、薯片等油炸马铃薯制品。咖啡豆在烘焙过程中，烘焙温度通常在180~240℃之间，这一温度区间恰为丙烯酰胺生成的最适温度范围。研究表明，轻度烘焙的咖啡豆中丙烯酰胺含量通常高于深度烘焙的咖啡豆，这是因为随着烘焙程度的加深，丙烯酰胺的生成速率与降解速率逐渐趋于平衡，且后续的降解反应逐渐占据主导地位。2015年，欧洲食品安全局（EFSA）发布了关于食品中丙烯酰胺的全面科学意见，确认了丙烯酰胺对实验动物的遗传毒性、致癌性以及生殖发育毒性，并指出丙烯酰胺对人类健康构成潜在威胁。基于此，欧盟委员会于2017年11月20日发布了欧盟法规(EU)2017/2158，首次针对各类食品建立了丙烯酰胺的“基准水平”（BenchmarkLevels），并要求食品生产经营者采取缓解措施以降低食品中丙烯酰胺的含量。该法规中关于咖啡及其代用品的丙烯酰胺基准水平设定如下：-烘焙咖啡豆（Roastcoffee）：350μg/kg-速溶咖啡（Instantcoffee）：850μg/kg-咖啡代用品（Coffeesubstitutes）：500μg/kg上述基准水平虽非法定限量标准，但若食品中丙烯酰胺含量持续超过基准水平，监管机构将要求生产企业审查其加工工艺流程并采取必要的缓解措施。此外，美国加利福尼亚州根据《安全饮用水和有毒物质执行法案》（即“第65号提案”）要求含有丙烯酰胺的咖啡产品须标注致癌警告。中国也于2017年发布了《食品中丙烯酰胺污染控制规范》（征求意见稿），并持续关注食品中丙烯酰胺的监测与风险评估工作。1.2咖啡产业概况与标准需求分析咖啡是全球贸易量最大的农产品之一，仅次于石油。根据国际咖啡组织（ICO）的统计数据，全球咖啡年产量约为一千万吨，消费市场规模超过2000亿美元。全球约有1.25亿人口以咖啡产业为生，咖啡贸易涉及超过60个发展中国家。中国作为新兴的咖啡消费市场，近年来咖啡消费量呈两位数增长态势，已成为全球增长最快的咖啡消费市场之一。与此同时，中国的咖啡种植业在云南、海南等省份也取得了长足发展，云南咖啡产量已占全国总产量的98%以上。随着咖啡消费量的持续增长和国际贸易的不断扩大，咖啡及其制品的质量安全监控需求日益凸显。丙烯酰胺作为咖啡加工过程中必然产生的潜在危害物，已成为各国食品安全监管机构重点关注的对象。然而，在国际标准化组织（ISO）发布本标准之前，丙烯酰胺的检测方法虽已由欧洲标准化委员会（CEN）制定了EN16618:2015《食品中丙烯酰胺的测定液相色谱-串联质谱法》，但该标准主要适用于各类食品基质，并未针对咖啡这一类高基质干扰、低含量水平的特殊食品基质进行专门的验证和优化。因此，制定一项专门针对咖啡及咖啡制品中丙烯酰胺检测的国际标准，具有重要的现实意义和迫切的技术需求。二、标准立项背景与研制历程2.1国际标准化组织及食品技术委员会概况国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization，ISO）成立于1947年2月23日，是全球最大的非政府性国际标准化机构，总部位于瑞士日内瓦。ISO的宗旨是在世界范围内促进标准化工作的开展，以利于国际物资交流和互助，并扩大知识、科学、技术和经济方面的合作。截至目前，ISO拥有来自165个国家的国家标准机构成员，已发布国际标准超过25000项，涵盖几乎所有技术领域。ISO/TC34（食品技术委员会）是ISO中负责食品领域标准制定的技术委员会，其秘书处承担方为法国标准化协会（AFNOR）。ISO/TC34下设多个分技术委员会（SC），其中ISO/TC34/SC15分技术委员会专门负责“咖啡、咖啡代用品及其制品”领域的国际标准制修订工作，其秘书处承担方为巴西标准化机构（ABNT）和英国标准协会（BSI）联合承担。ISO/TC34/SC15现行的标准体系覆盖了咖啡生豆、烘焙咖啡豆、速溶咖啡、咖啡饮品及咖啡副产物等全产业链的术语、规格、取样、感官分析、物理分析和化学分析方法等方面。2.2国际标准制定阶段与双层级审议机制ISO国际标准的制定遵循严格的程序性规范（ISO/IECDirectivesPart1），通常包括以下阶段：（1）提案阶段（NP）：由成员国或技术委员会提交新工作项目提案（NewWorkItemProposal），经委员会内部投票表决通过后正式立项；（2）准备阶段（WD）：成立工作组（WorkingGroup），由项目负责人（ProjectLeader）牵头起草工作草案（WorkingDraft）；（3）委员会阶段（CD）：工作草案经工作组反复讨论修改后，形成委员会草案（CommitteeDraft），分发至各成员国征求意见；（4）征询意见阶段（DIS）：委员会草案经修改完善后，形成国际标准草案（DraftInternationalStandard），提交各成员国进行投票表决（赞成、反对或弃权），投票周期为12周；（5）批准阶段（FDIS）：DIS草案经编辑性修改后形成最终国际标准草案（FinalDraftInternationalStandard），再次提交各成员国投票，投票周期为8周；（6）出版阶段（IS）：最终草案经批准后，由ISO中央秘书处负责排版和出版，正式发布为国际标准。值得特别说明的是，ISO对国际标准实行每五年进行一次系统性复审（systematicreview）的机制。各成员国根据标准实施情况、技术发展水平和市场需求，投票决定该标准应予以“确认继续有效（confirm）”、“修订（revise）”、“修订补充（amend）”或“废止（withdraw）”。这一复审机制确保了ISO标准始终与技术进步和行业需求保持同步更新。ISO18862:2025正是在上述标准的立项和制定框架下完成的。该标准项目由ISO/TC34/SC15/WG10工作组承担研制工作。工作组在广泛收集各国关于丙烯酰胺检测方法研究成果的基础上，通过对多种候选方法的技术验证、实验室间协同试验（collaborativestudy）和统计学评价，最终确定了以衍生化处理结合HPLC-MS/MS和GC-MS两种检测技术为核心方法的技术方案。2.3主要参与单位本标准的主要参与技术力量来源于巴西农业研究公司（Embrapa）。巴西作为全球最大的咖啡生产国和出口国，其咖啡产量约占全球总产量的三分之一。巴西农业研究公司（EmpresaBrasileiradePesquisaAgropecuária，简称Embrapa）是巴西政府于1973年设立的农业科学研究机构，隶属于巴西农业、畜牧业和食品供应部，总部位于巴西利亚。Embrapa下设数十个专业研究中心，其中Embrapa食品技术研究中心（EmbrapaAgroindústriadeAlimentos）位于里约热内卢，是巴西食品科学与技术领域最具权威性的研究机构之一。Embrapa食品技术研究中心设有专门的食品安全与分析化学实验室，具备完善的色谱-质谱联用分析平台，包括高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）以及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等大型精密仪器设备。该实验室在食品加工污染物分析领域拥有超过二十年的研究积累，尤其在丙烯酰胺的生成机制、检测方法开发和风险评估方面开展了大量系统性的研究工作。在ISO18862:2025的研制过程中，Embrapa的技术团队承担了以下关键工作：首先，系统开展了咖啡基质中丙烯酰胺检测方法的前期研究，包括对衍生化试剂（如溴化衍生化）的优化选择、衍生化反应条件的系统优化、净化方法（如固相萃取）的筛选等工作；其次，牵头组织了多项实验室间协同试验，协调来自巴西、德国、日本、英国、瑞士、韩国等多个国家的权威检测实验室参与方法验证，通过对不同烘焙程度、不同产品类型（咖啡豆、速溶咖啡、咖啡代用品等）的实际样品测试，全面评价了该方法的准确性、精密度、灵敏度、线性和适用性等关键技术指标；此外，Embrapa的技术团队还负责起草了标准文本的技术内容，包括方法原理的描述、试剂和材料的规格要求、仪器设备的配置参数、样品前处理步骤的详细规定、色谱质谱条件的推荐、定量方法的确定以及质量保证和控制措施的制定等。通过上述工作，Embrapa为ISO18862:2025的顺利制定和发布提供了坚实的技术支撑，充分体现了巴西作为全球最大咖啡生产国在国际咖啡标准化领域的主导地位和技术贡献。三、标准主要内容3.1范围与适用性ISO18862:2025规定了采用衍生化后HPLC-MS/MS和GC-MS两种方法测定咖啡和咖啡制品中丙烯酰胺含量的技术要求和操作程序。该标准适用于烘焙咖啡豆、研磨咖啡粉、速溶咖啡、液态咖啡饮品以及咖啡代用品中丙烯酰胺含量的测定。方法的定量限（LOQ）为10μg/kg，能够满足欧盟(EU)2017/2158法规中咖啡及咖啡代用品丙烯酰胺基准水平的检测要求。3.2方法原理丙烯酰胺分子量小（71.08）、极性高、缺乏特征性发色团和荧光基团，这给其在复杂食品基质中的准确定量带来了较大挑战。ISO18862:2025确立的方法采用衍生化技术对丙烯酰胺进行化学转化，以提高其色谱分离效率和质谱检测灵敏度。具体而言，该方法基于以下反应原理：样品中的丙烯酰胺在酸性条件下与溴化试剂（溴化钾-溴酸钾体系）发生亲电加成反应，生成α,β-二溴丙酰胺（2,3-dibromopropanamide，2,3-DBPA）。该衍生化产物具有显著改善的色谱保留行为和优异的质谱响应特性，能够有效克服丙烯酰胺本身极性过强导致的色谱峰形拖尾和离子化效率低等不利因素。衍生化反应完成后，以乙酸乙酯进行液-液萃取（LLE）或采用固相萃取（SPE）小柱净化，去除基质干扰物后，分别采用HPLC-MS/MS和GC-MS两种模式进行检测。在HPLC-MS/MS模式下，2,3-DBPA经反相色谱柱分离后，在电喷雾电离源（ESI）正离子模式下电离，以多反应监测（MRM）模式采集信号，定量离子对为m/z152→135（母离子为[M+H]+，对应2,3-DBPA的质子化分子离子），定性离子对为m/z152→106和m/z154→136（为溴的同位素特征峰）；在GC-MS模式下，经过衍生化的样品溶液直接进样气相色谱仪，采用毛细管色谱柱分离后在电子轰击电离源（EI，70eV）下电离，选择离子监测（SIM）模式采集m/z152、m/z106等特征离子进行定性和定量分析。两种检测模式互为补充，HPLC-MS/MS具有更高的灵敏度和选择性，适用于大批量样品的快速筛查；GC-MS则在普及性和方法稳健性方面具有优势，适合作为验证方法或在没有液相色谱-串联质谱设备的实验室中使用。3.3样品前处理标准对样品前处理流程作出了详细规定，主要步骤包括：（1）样品粉碎与均质：烘焙咖啡豆