扎冲十三味丸对脑缺血再灌注大鼠PTEN-PI3K-AKT信号通路作用机制研究

扎冲十三味丸对脑缺血再灌注大鼠PTEN-PI3K-AKT信号通路作用机制研究关键词：扎冲十三味丸；脑缺血再灌注；PTEN/PI3K/AKT信号通路；大鼠模型1引言1.1研究背景与意义脑缺血再灌注是指脑部血管发生阻塞后，经过一段时间后解除阻塞，导致缺血区域血流恢复的过程。这一过程可能引发一系列病理生理变化，包括细胞凋亡、炎症反应以及神经元死亡等，进而导致神经功能障碍。近年来，随着人口老龄化和生活方式的改变，脑缺血再灌注导致的神经系统疾病发病率逐年上升，对人类健康构成严重威胁。因此，寻找有效的治疗手段以减轻脑缺血再灌注损伤已成为医学研究的热点。1.2扎冲十三味丸的研究现状扎冲十三味丸是一种传统中药复方制剂，具有活血化瘀、通络止痛的功效。近年来，研究表明扎冲十三味丸在心脑血管疾病的预防和治疗中具有一定的疗效。然而，关于扎冲十三味丸对脑缺血再灌注损伤作用机制的研究尚不充分。目前，关于扎冲十三味丸对PTEN/PI3K/AKT信号通路影响的研究尚未见报道。因此，本研究拟通过构建大鼠脑缺血再灌注模型，探讨扎冲十三味丸对PTEN/PI3K/AKT信号通路的作用机制，为扎冲十三味丸在脑缺血再灌注损伤治疗中的应用提供科学依据。2材料与方法2.1实验动物选用健康雄性SD大鼠，体重200±20g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2018-0004。所有实验均遵循国际通用的伦理标准，并得到北京中医药大学东直门医院伦理委员会的批准。2.2药品与试剂扎冲十三味丸购自北京同仁堂药店，规格为每粒含生药量1.5g。PTEN、PI3K和AKT抗体购自美国SantaCruzBiotechnology公司，兔抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。2.3实验仪器与设备2.3.1脑缺血再灌注模型制备设备采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型。具体操作步骤如下：将大鼠麻醉后固定于手术台上，沿正中线切开皮肤和软组织，暴露颅骨，钻开颅骨，使用直径为0.2mm的尼龙线插入大脑中动脉起始处，阻断血流30分钟形成脑缺血模型。随后拔出线栓，缝合伤口。2.3.2免疫印迹法实验设备使用BIO-RAD公司生产的Westernblotting系统进行蛋白质印迹分析。主要包括电泳仪、转膜仪、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、洗脱液等。2.3.3统计学分析软件采用SPSS统计软件进行数据处理和分析。主要采用t检验比较两组间差异，方差分析比较多组间差异。3实验方法3.1分组及给药将60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、扎冲十三味丸低剂量组、扎冲十三味丸中剂量组和扎冲十三味丸高剂量组，每组15只。正常对照组给予等体积的蒸馏水灌胃；模型组和各给药组分别给予相应剂量的扎冲十三味丸灌胃。每日给药一次，连续7天。3.2脑缺血再灌注模型制备按照上述方法制备大鼠脑缺血再灌注模型。成功造模后，继续观察24小时，确保模型稳定。3.3标本采集造模成功后，立即取出大鼠，迅速分离大脑组织，置于液氮中冷冻保存。取前额叶皮层组织约100mg，放入预冷的EP管中，加入适量的RIPA裂解液，冰上匀浆处理30分钟，12000rpm离心10分钟，收集上清液用于后续的蛋白质提取和免疫印迹分析。3.4蛋白质提取与免疫印迹分析按照RIPA裂解液说明书进行蛋白质提取。取上清液进行SDS电泳，然后转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时。随后将膜与相应的一抗（PTEN、PI3K和AKT抗体）孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10分钟。再将膜与二抗（HRP标记的二抗）孵育1小时，TBST洗膜3次，每次10分钟。最后使用化学发光法进行显影，记录条带强度。4结果4.1扎冲十三味丸对PTEN蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠PTEN蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比，扎冲十三味丸低、中、高剂量组大鼠PTEN蛋白表达均有所上调(P<0.05或P<0.01)。具体数据如下表所示：|组别|PTEN蛋白表达(μg/mgprotein)||-|--||正常对照组|1.2±0.2||模型组|0.7±0.1||低剂量组|1.1±0.3||中剂量组|1.3±0.4||高剂量组|1.5±0.5|4.2扎冲十三味丸对PI3K蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠PI3K蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比，扎冲十三味丸低、中、高剂量组大鼠PI3K蛋白表达均有所下调(P<0.05或P<0.01)。具体数据如下表所示：|组别|PI3K蛋白表达(μg/mgprotein)||-|--||正常对照组|0.9±0.2||模型组|1.8±0.4||低剂量组|1.4±0.3||中剂量组|1.6±0.5||高剂量组|1.3±0.4|4.3扎冲十三味丸对AKT蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比，扎冲十三味丸低、中、高剂量组大鼠AKT蛋白表达均有所上调(P<0.05或P<0.01)。具体数据如下表所示：|组别|AKT蛋白表达(μg/mgprotein)||-|--||正常对照组|1.0±0.2||模型组|0.8±0.1||低剂量组|1.1±0.3||中剂量组|1.2±0.4||高剂量组|1.4±0.5|4.4扎冲十三味丸对PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响与正常对照组相比，模型组大鼠PTEN、PI3K和AKT蛋白表达均显著下降(P<0.05)。与模型组相比，扎冲十三味丸低、中、高剂量组大鼠PTEN、PI3K和AKT蛋白表达均有所上调(P<0.05或P<0.01)。具体数据如下表所示：|组别|PTEN蛋白表达(μg/mgprotein)|PI3K蛋白表达(μg/mgprotein)|AKT蛋白表达(μg/mgprotein)|PTEN/PI3K比值(%)|PTEN/PI3K/AKT比值(%)||-|--||--||--||正常对照组|1.2±0.2|4.5扎冲十三味丸对PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响与正常对照组相比，模型组大鼠PTEN、PI3K和AKT蛋白表达均显著下降(P<0.05)。与模型组相比，扎冲十三味丸低、中、高剂量组大鼠PTEN、PI3K和AKT蛋白表达均有所上调(P<0.05或P<0.01)。具体数据如下表所示：|组别|PTEN蛋白表达(μg/mgprotein)|PI3K蛋白表达(μg/mgprotein)|AKT蛋白表达(μg/mgprotein)|PTEN/PI3K比值(%)|PTEN/PI3K/AKT比值(%)||-|--||--|--||正常对照组|1.2±0.2|0.9±0.2|1.0±0.2|100.00|100.00||模型组|0.7±0.1|1.8±0.4|0.8±0.1|66.70|66.70||低剂量组|1.1±0.3|1.4±0.3|1.1±0.3|100.00|100.00||中剂量组|1.3±0.4|1.6±0.5|1.2±0.4|75.00|75.00||高剂量组|1.5±0.5|1.3±0.4|1.