药品生物检定技术（第2版）课件 第三篇 第十三章 其他常见药物的生物活性检定

第十六章其他常见药物的生物活性检定目录01人凝血因子Ⅷ02人凝血酶原复合物03肝素学习目标1.掌握凝血因子类血液制品和肝素生物测定的实验过程。2.熟悉凝血因子类血液制品和肝素生物测定的原理。3.了解凝血因子类血液制品和肝素基本的临床应用。知识目标1.能根据标准操作规程，规范进行肝素的生物测定操作。2.提高读懂、理解《中国药典》等质量标准的能力。能力目标1.养成勤于思考、善于思维的学习习惯。2.培养严格依规操作的职业理念。素养目标凝血机制人凝血机制示意图主要凝血因子因子I，纤维蛋白原因子II，凝血酶原因子Ⅲ，组织因子因子Ⅳ，钙离子因子Ⅴ，促凝血球蛋白原因子Ⅶ，促凝血酶原激酶原因子Ⅷ，血友病因子A因子Ⅸ，血友病因子B因子Ⅹ，自体凝血酶原C因子ⅩⅠ，抗血友病球蛋白C因子ⅩⅡ，表面因子因子ⅩⅢ，血纤维稳定因子抗凝血药物作用机制抗凝血药物种类凝血酶间接抑制药：肝素类凝血酶直接抑制药：香豆素类、水蛭素纤维蛋白溶解药：链激酶、尿激酶、阿尼普酶抗血小板药：阿司匹林、双嘧达莫、依前列醇、噻氯吡啶第一节人凝血因子Ⅷ人凝血因子Ⅷ效价测定受检测方法的影响较大，常用的方法为基于活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）的一期凝固法。其原理是在37℃件下，在受检血浆中加入APTT试剂（XII因子激活剂和脑磷脂），以白陶土激活Ⅻ因子，最后加入钙离子后，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间。它对除Ⅶ因子以外所有的凝血因子都很敏感。《中国药典》2025年版四部也收载了第二法生色底物法。检定方法：取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温4分钟，加入凝血因子Ⅷ缺乏血浆0.1ml、标准品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温5min。加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用不同浓度的供试品溶液0.1ml替代标准品溶液，同法操作。

以系列标准品溶液（或系列供试品溶液）效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作线性回归，照生物检定统计法（《中国药典》2025年版四部通则1431）中的量反应平行线测定法计算供试品效价及95%置信区间，其95%置信区间应在测得效价的80%～120%。供试品溶液和标准品溶液的剂量反应曲线回归项应非常显著（P＜0.01），偏离平行和偏离线性均应不显著（P≥0.01）。注意事项：1.自“用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆或0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ的溶液”起，依法操作，独立制备2份系列标准品溶液和供试品溶液，平行测定。同一浓度的两份溶液凝固时间的相对偏差不得过10%，否则应重测。2.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。3.如采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。4.偏离线性项变异的差方和与自由度（ƒ）计算公式：第二节人凝血酶原复合物人凝血酶原复合物（PCC）是由健康人血浆经分离纯化制成的凝血因子提取物，主要含有凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ。四种凝血因子具有极其相似的相对分子质量和等电点等理化性质，在规模生产时难以使用常规的分离手段将它们分离，故一般的商品皆含有上述四种因子。临床上PCC主要用于治疗乙型血友病和因维生素K缺乏或患肝病而引起的出血症状。人凝血酶原复合物的效价测定是分别测定人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的效价。

《中国药典》2025年版中，人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ三种因子的效价测定均是以人凝血因子缺乏血浆为基质血浆，采用基于血浆凝血酶原时间（prothrombintime，PT）的一期凝固法。其原理是在被检血浆中加入钙离子和组织因子（TF或组织凝血活酶），使凝血酶原转化为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，观测血浆的凝固时间。它是外源凝血系统较为灵敏和最为常用的筛查试验。一、人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ检定方法

量取供试品溶液0.1ml，加待测人凝血因子缺乏血浆0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般3分钟），然后加入已预热至37℃的含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml，记录凝固时间。用不同稀释度的待测人凝血因子标准品溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。以待测人凝血因子标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作直线回归，求得直线回归方程，计算供试品溶液待测人凝血因子效价，再乘以稀释倍数，即为供试品待测人凝血因子效价（IU/ml）。注意事项：1.直线回归相关系数应不低于0.98。2.测定时要求每个稀释度平行测定2管，2管之差不得超过均值10%，否则重测。3.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。4.采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。人凝血因子Ⅸ效价的测定方法与人凝血因子Ⅷ类似，采用基于活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）的一期凝固法和生色底物法。二、人凝血因子Ⅸ检定方法检定方法：

取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间（一般4分钟），加入凝血因子Ⅸ缺乏血浆0.1ml、标准品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般5分钟），加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用不同浓度的供试品溶液0.1ml替代标准品溶液，同法操作。

以系列标准品溶液（或系列供试品溶液）效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作线性回归，照生物检定统计法（《中国药典》2025年版四部通则1431）中的量反应平行线测定法计算供试品效价及95%置信区间，其95%置信区间应在测得效价的80%～125%。供试品溶液和标准品溶液的剂量反应曲线相关系数均应不低于0.98，回归项应非常显著（P＜0.01），偏离平行和偏离线性均应不显著（P≥0.01）。注意事项：1.自“用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆或0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅸ的溶液”起，依法操作，独立制备2份系列标准品溶液和供试品溶液，平行测定。同一浓度的两份溶液凝固时间的相对偏差不得过10%，否则应重测。2.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。3.如采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。4.偏离线性项变异的差方和与自由度（f）计算公式：第三节肝素肝素是哺乳动物体内含有的一种天然酸性黏多糖，它与蛋白质结合成复合体的形式存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，故不显抗凝血作用。肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化、心脑血管疾病的有效药物。低分子肝素是由普通肝素解聚制备而成的一类分子量较低的肝素的总称。普通肝素平均分子量为15000Da，分子量小于6000Da的统称为低分子肝素。肝素钠效价测定，以前大多采用凝血时间测定法。从《中国药典》2015年版二部中，将抗Ⅱa因子/抗Xa因子效价测定法被纳入肝素钠、肝素钙效价测定项下，2025年版中，本法作为通则1208肝素生物测定法中的第一法，凝血时间测定法为第二法。一、抗Ⅱa因子/抗Xa因子效价测定法

本法系通过微量显色法比较肝素标准品与供试品抗Ⅱa因子和抗Xa因子的活性，以测定供试品的效价。（一）抗Ⅱa因子测定法

按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次分别精密加入20~100μl相同体积的上述溶液；每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入凝血酶溶液适量，混匀，37℃平衡2min；再精密加入发色底物溶液适量，混匀，37℃保温2min后，再精密加入50%醋酸溶液适量（2V）终止反应，迅速冷却至室温。405nm的波长处测定各管吸光度。按照量反应平行线原理4·4法实验设计，计算效价及实验误差。

本法的可信限率（FL%）不得大于10%。（二）抗Ⅹa因子测定法

按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次分别精密加入20~100μl相同体积的上述溶液；每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入Xa因子溶液适量，混匀，37℃平衡2min；再精密加入发色底物溶液适量，混匀，37℃保温2min后，再精密加入50%醋酸溶液适量（2V）终止反应，迅速冷却至室温。405nm的波长处测定各管吸光度。按照量反应平行线原理4·4法实验设计，计算效价及实验误差。

本法的可信限率（FL%）不得大于10%。（三）凝血时间测定法1．兔全血法

取管径均匀（0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm）、清洁干燥的小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.1ml，每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量，分别注入小试管内，每管0.9ml，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。将小试管置37℃±0.5℃恒温水浴中，从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3min，注意观察并记录各管的凝结时间。

本法的可信限度FL（%）不得大于10%。2．血浆复钙法

取上述规格的小试管若干支，分别加入血浆一定量，置37℃±0.5℃恒温水浴中预热5～10min后，依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及1%氯化钙溶液，每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等。血浆、肝素稀释液和氯化钙溶液的加入量分别为0.5、0.4和0.1ml（或0.8、0.1和0.1ml），加入氯化钙溶液后，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。注意观察并记录各管凝结时间。

本法的可信限率FL（%）不得大于5%。3．APTT法

取凝血分析仪样品管若干，每管依次加入血浆50μl，一种浓度的标准品或供试品稀释液50μl，APTT试剂50μl，混匀，应避免产生气泡。37℃±0.5℃预热180s后，每管再加入CaCl250μl，然后立即用凝血分析仪测定凝结时间，即活化部分凝血活酶时间（APTT）。标准品或供试品稀释液每个浓度的测定次数不得少于3次，各浓度的测定次数应相同。测定时，血浆、标准品或供试品稀释液、APTT试剂、CaCl2

试剂的加入比例和预温时间可根据仪器或试剂的说明书适当调整。将上述方法测得的凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

本法的可信限率FL（%）不得大于10%。注意事项1．用新鲜兔血检定时，取血要求出血快，一般多采用动脉取血。2．血液加入预