ISOTS 110592025 牛奶和奶制品-假单胞菌属的计数方法标准立项发展报告

牛奶和奶制品——假单胞菌属的计数方法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:MilkandMilkProducts—MethodfortheEnumerationofPseudomonasspp.摘要随着乳制品工业的全球化发展和消费者对乳品质量安全要求的持续提升，假单胞菌属（*Pseudomonas*spp.）作为乳品冷藏条件下最主要的腐败菌群，其快速、准确计数已成为国际乳品行业质量控制的重点方向。本报告以国际标准化组织（ISO）发布的技术规范ISO/TS11059:2025《牛奶和奶制品——假单胞菌属的计数方法》为研究对象，系统分析了该标准的立项背景、技术内容、修订历程及行业应用价值。报告指出，该标准在原有ISO/TS11059:2009版本基础上，针对培养基选择性、培养温度与时间、菌落确认程序等关键技术参数进行了优化，引入了更具特异性的选择性培养基配方，提高了对目标菌属计数的准确性和可重复性。标准的发布对于规范国际贸易中乳品微生物检验程序、促进检测结果国际互认、推动乳品行业冷链质量管控技术升级具有重要意义。本报告还就该标准在实验室应用中的关键控制点、与国内相关标准的协调性以及未来发展方向进行了探讨，为相关企事业单位和检验检测机构的标准实施提供参考。关键词：假单胞菌属；牛奶和奶制品；微生物计数；国际标准；ISO/TS11059；食品安全；质量控制Keywords:Pseudomonasspp.;Milkandmilkproducts;Microbiologicalenumeration;Internationalstandard;ISO/TS11059;Foodsafety;Qualitycontrol一、引言1.1研究背景乳及乳制品因其丰富的营养成分（蛋白质、脂肪、乳糖及矿物质等），为微生物的生长繁殖提供了极为理想的基质。在众多乳品相关微生物中，假单胞菌属（*Pseudomonas*spp.）是一类需氧、革兰氏阴性、氧化酶阳性的杆状细菌，广泛存在于水、土壤、空气及动植物表面。该属中诸如荧光假单胞菌（*P.fluorescens*）、恶臭假单胞菌（*P.putida*）等菌种能够在低温（2-7°C）条件下旺盛生长，是冷藏乳及乳制品中最重要的腐败菌群之一。假单胞菌在生长过程中可分泌耐热性脂肪酶和蛋白酶，这些酶类即使在巴氏杀菌后仍可保持活性，导致乳制品出现苦味、凝块、脂肪氧化酸败等品质缺陷。据统计，由假单胞菌引起的冷藏乳制品腐败变质占所有微生物性腐败的比例高达70%以上，每年给全球乳品工业造成数十亿美元的经济损失。1.2标准立项的必要性在国际乳品贸易日益频繁的背景下，不同国家和地区对假单胞菌属的检测方法存在较大差异。部分国家采用平板计数法（PCA）结合培养特性进行推定计数，另一些国家则采用特定的选择性培养基进行分离计数，方法的不统一导致检测结果缺乏可比性，严重影响了国际贸易中乳品质量的判定与争议解决。此外，现行国际标准ISO8552:2004《牛奶——假单胞菌属的计数方法》主要适用于原料奶中假单胞菌的计数，但未完全覆盖巴氏杀菌乳、发酵乳、奶油、乳粉等多种乳制品基质。随着乳品产品种类的不断丰富和加工工艺的多样化发展，亟需建立一套适用于多种乳品基质且具有良好重复性和再现性的假单胞菌属计数方法标准。二、标准概况2.1标准基本信息ISO/TS11059:2025《牛奶和奶制品——假单胞菌属的计数方法》由国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization,ISO）下设的乳及乳制品技术委员会ISO/TC34/SC5（食品产品技术委员会乳及乳制品分技术委员会）负责制定。该标准为技术规范（TechnicalSpecification,TS）类文件，于2025年12月12日正式发布，取代了此前实施的ISO/TS11059:2009版本。2.2标准定位与适用范围本技术规范规定了牛奶和奶制品中假单胞菌属菌落计数的通用方法。适用于原料乳、巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳（UHT乳）、发酵乳、稀奶油、乳粉、炼乳及乳基婴幼儿食品等多种乳制品基质中假单胞菌属的计数检测。标准规定的检测方法基于选择性培养基上的菌落形成单位（Colony-FormingUnits,CFU）计数原理，采用倾注平板法（PourPlateTechnique）结合表面涂布法（SpreadPlateTechnique）的双轨策略，以适应不同污染水平和基质特性的样品需求。2.3与前一版本的主要技术变化相较于ISO/TS11059:2009版本，2025版在以下关键技术要素上进行了实质性修订：（1）培养基配方的优化新版标准将选择性培养基中的选择性添加剂进行了调整，以进一步提高对假单胞菌属的选择性。原有的甘油-尿素-头孢菌素选择性体系被改良为含有头孢菌素、呋喃唑酮及先锋霉素等多种抗生素复合体系的配方，在有效抑制革兰氏阳性菌、酵母菌和霉菌生长的同时，降低了对部分假单胞菌菌株的潜在毒性。（2）培养条件的细化新标准对不同乳品基质的培养温度和培养时间做出了更细致的差异化规定。针对原料乳和巴氏杀菌乳样品，推荐在30°C±1°C条件下培养48小时±2小时；对于发酵乳及含有较高背景菌群的样品，增加了25°C±1°C条件下培养72小时±2小时的替代方案，以提高对受损菌株的恢复率和检出率。（3）菌落确认程序的标准化新版标准引入了更加系统的菌落确认程序。在选择性培养基上生长后，典型菌落需经过氧化酶试验、荧光色素产生试验及革兰氏染色等确认步骤。标准明确了各确认试验的操作规程和判定标准，对可疑菌落的确认采用了“至少选取5个典型菌落”的规定，以确保计数结果的代表性。（4）方法性能参数的完善新版标准通过国际实验室间协同试验（InterlaboratoryCollaborativeTrial）获得了完整的性能参数数据。在原料乳基质中，方法的检出限达到10CFU/mL；定量限为100CFU/mL。重复性标准差（RepeatabilityStandardDeviation,sᵣ）和再现性标准差（ReproducibilityStandardDeviation,sR）在不同污染水平下的Horrat值均小于2.0，满足方法性能可接受标准。三、方法原理与关键技术内容3.1检测原理本方法的核心原理是利用假单胞菌属菌株在特定选择性培养基上生长形成可见菌落，通过对菌落进行计数并辅以生化确认试验来确定样品中假单胞菌属的数量。方法将选择性培养技术与确认性生化试验相结合，兼顾了检测效率与结果的特异性。3.2关键技术流程（1）样品制备依据样品种类选择相应的前处理方式。液态乳制品（原料乳、巴氏杀菌乳、UHT乳）经充分混匀后直接用于制备初始悬浮液；半固态样品（发酵乳、稀奶油）需在无菌条件下称取适当量后加入预热至45°C±1°C的蛋白胨盐稀释液中均质；乳粉类样品则需按照标准规定的比例进行复原后检测。所有稀释操作采用无菌蛋白胨盐溶液作为稀释液。（2）接种与培养每个适宜稀释度取1mL样品悬浮液注入无菌平皿中，倾注约15mL冷却至47°C±1°C的选择性培养基，混匀后待凝。对于预期污染水平较低的样品，可采用0.1mL表面涂布法以提高灵敏度。培养条件为30°C±1°C培养48小时±2小时，或根据样品类型选择替代培养条件。（3）菌落计数培养结束后，选取菌落数在10-150CFU之间的平皿进行计数。对于菌落过多或蔓延生长无法计数的平皿应予以淘汰。计数结果以每毫升（每克）样品中假单胞菌属的菌落形成单位数（CFU/mL或CFU/g）表示。（4）确认试验从计数的平皿中选取至少5个典型菌落进行氧化酶试验。假单胞菌属为氧化酶阳性菌（但需注意少部分伯克霍尔德菌属等亲缘菌株亦为氧化酶阳性）。必要时可补充进行荧光色素产生试验（在King'sB培养基上于25°C培养观察）和革兰氏染色（假单胞菌属为革兰氏阴性杆菌）。3.3质量保证要求标准对实验室质量控制提出了明确要求：-每批样品检测需同时进行阳性对照（如*Pseudomonasfluorescens*ATCC13525）和阴性对照试验；-稀释液和培养基的空白对照必须无菌落生长；-建议实验室定期参加能力验证（ProficiencyTesting）计划，以持续监控检测结果的准确性。四、标准的行业影响与应用价值4.1对乳品企业质量控制的意义当前，乳品行业冷链物流体系日益完善，产品货架期不断延长，低温流通环节中假单胞菌属的增殖控制成为决定产品质量稳定性的关键因素。本标准的发布为企业提供了一套科学、统一的检测工具，使得不同企业、不同实验室之间的检测数据具备了横向比较的基础。通过标准化的检测结果，企业可以更加精确地评估原料奶的卫生质量等级，优化加工工艺参数（如巴氏杀菌温度与时间组合），验证冷链运输过程中的温度控制效果，并为产品货架期的预测提供微生物学依据。4.2对国际贸易的促进作用在国际乳品贸易中，微生物指标是贸易双方合同评审和入境检验的重要依据。尽管假单胞菌属计数并非所有国家乳品法规中的强制项目，但在部分国家的乳品质量标准中，假单胞菌属最大允许限量已作为原料奶收购的质量分级指标之一。ISO/TS11059:2025作为经国际协同验证的标准方法，为各国间检测结果互认铺平了道路。当贸易双方因检测方法差异产生争议时，可由双方认可的第三方实验室依据本国际标准进行仲裁检测。这不仅降低了重复检测的成本，也提升了质量争议解决效率。五、国内标准的协调与应用现状当前，我国与假单胞菌属检测相关的标准主要包括GB4789系列食品安全国家标准。然而，我国现行标准体系中尚无专门针对乳制品中假单胞菌属计数的专用方法标准。在行业实践中，各检测机构通常参照GB4789.2（菌落总数测定）结合生化鉴定方法进行推定计数，但该方法难以实现假单胞菌属与其他嗜冷菌的有效区分。ISO/TS11059:2025的发布有望推进我国在该领域标准体系的完善进程。全国食品工业标准化技术委员会及全国乳品标准化技术委员会可结合我国乳品行业实际，在评估该方法在我国实验室条件下的适用性基础上，适时将其转化为行业标准或国家标准。六、主要参与单位介绍6.1国际标准化组织乳及乳制品分技术委员会（ISO/TC34/SC5）ISO/TC34/SC5是国际标准化组织食品产品技术委员会（ISO/TC34）下设的分技术委员会之一，其秘书处由法国标准化协会（AFNOR）承担。该分委会的职责范围涵盖乳及乳制品领域的术语、取样方法、检验方法及产品规格等标准的制定与修订工作，是国际乳品标准化活动的核心机构。ISO/TC34/SC5目前拥有来自全球50余个国家的正式成员（ParticipatingMembers,P成员）和观察成员（ObservingMembers,O成员）。中国作为该分委会的正式成员之一，由中国标准化研究院及中国食品发酵工业研究院有限公司的代表参与相关工作。此外，国际乳品联合会（InternationalDairyFederation,IDF）与该分委会保持着紧密的协作关系（ISO/IDF合作关系），双方通过联合工作组（JointWorkingGroup,JWG）的形式共同推进乳品微生物检测方法标准的制定。在ISO/TS11059:2025的制定过程中，ISO/TC34/SC5下属的微生物学工作组（WG3）具体承担了技术草案的编制和修订工作。该工作组汇聚了来自法国、荷兰、德国、新西兰、美国、中国等乳业发达国家及主要贸易国的微生物学专家，以及IDF委派的联合专家。工作组在2019年至2025年間召开了多轮工作会议和网络研讨会，先后完成了工作草案（WorkingDraft,WD）、委员会草案（CommitteeDraft,CD）和国际标准草案（DraftInternationalStandard,DIS）各阶段的审查和技术评审。在标准制定过程中，多国实验室参与的协同试验是关键环节。协同试验严格遵循ISO5725（测量方法与结果的准确度）系列标准的要求，共有来自12个国家的18个实验室参与验证工作，覆盖了原料乳（牛乳和羊乳）、巴氏杀菌乳、UHT乳、发酵乳和乳粉等主要基质类型，确保了验证数据的广泛代表性和方法在不同实验室条件下的适用性。七、结论与展望ISO/TS11059:2025《牛奶和奶制品——假单胞菌属的计数方法》作为国际乳品微生物检测标准体系的重要组成部分，为全球乳品行业提供了统一的假单胞菌属计数技术方法。该标准的发布不仅完善了国际乳品微生物检验方法标准库，也反映了当前乳品加工行业对嗜冷腐败菌精准管控的技术需求。未来，随着分子生物学技术的快速发展（如实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、宏基因组测序及免疫学快速检测技术等），假单胞菌属的检测有望朝着更加快速、灵敏和自动化的方向发展。ISO/TC34/SC5将可能在此技术规范的基础上，结合新兴检测技术的验证结果，逐步推进其向正式国际标准（IS）的升级转化，并开发快速筛查方法的配套标准。对于我国而言，积极跟踪并适时采用该国际标准，不仅有助于提升国内乳品微生物检测实验室的技术能力和国际竞争力，也为我国乳品企业拓展国际市场提供了有力的技术支撑。建议国内相关标准化技术机构尽快组织对该标准的技术评审和适用性评估，推动我国乳品微生物检测标准体系与国际标准的进一步接轨。参考文献[1]ISO/TS11059:2025,Milkandmilkproducts—MethodfortheenumerationofPseudomonasspp.,InternationalOrganizationforStandardization,2025.[2]ISO/TS11059:2009,Milkandmilkproducts—MethodfortheenumerationofPseudomonasspp.,InternationalOrganizationforSt