热考微专题18PCR技术的原理与应用

热考微专题18PCR技术的原理与应用真题示例例1(2025·河北卷)X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为13500，某患病男孩(其母亲没有患病)X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是(注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测。A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病例2(2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________________、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-________-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是________________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到____________________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。题后拓展1．PCR中设计引物的意义及一般原则意义(1)DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。(2)设计引物的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如图)一般原则(1)引物的长度一般在20～30bp(碱基)，太短则特异性不够强，太长则复性温度会比较高。(2)引物G＋C含量以40%～60%为宜，太少扩增效果不佳，过多则易出现非特异性条带。4种碱基最好随机分布。(3)两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段或影响PCR扩增反应的效率。(4)一条引物自身不能有大于4bp(碱基)的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的复性。(5)两条引物的复性温度相差不能大于5℃。操作时一般选择较低的那个复性温度，如果相差太大，另一条引物的非特异性结合就会增加2．引物的特殊应用添加酶切位点在PCR引物的5′端加上根据需要而设计的限制酶酶切位点，PCR产物内部无该切点反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外DNA片段即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增(见下图)反馈即练1．(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是()A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落2．(2024·浙江6月卷)阅读下面的材料，完成下列小题。疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。(1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是()A．F1—R1引物可用于特异性地扩增目的片段B．F1—R2引物不能用于特异性地扩增目的片段C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段(2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。注：泳道号对应血样号。1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是()A．1号和6号B．2号和4号C．3号和5号D．1号、2号、4号和6号3．(2025·河南卷)某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：(1)该紧凑株型性状由________(填“A”或“a”)基因控制。(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图Ⅰ)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)研究人员设计了3条引物(P1～P3)，位置如图Ⅰ(→表示引物5′→3′方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图Ⅱ-A和Ⅱ-B(不考虑PCR结果异常)。①图Ⅱ-A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是________________________________________________________________________________________________________________