CN119403936A 用于获得单细胞的关联的图像和序列数据的方法和组合物 （贝克顿·迪金森公司）

2024.12.09PCT/US2023/0183752023.04.12WO2023/205020EN2023.10.26用于获得单细胞的关联的图像和序列数据本发明的方面包含获得单细胞的关联的图成员/寡核苷酸子条形码将细胞组合条形码化以区以产生各自具有组合条形码的分区的组合条2用特异性结合成员/寡核苷酸子条形码将所述细胞样品的细胞组合条形码化以产生组将所述组合条形码化的细胞分区以产生各自具有组合条形码的分区的组合条形码化将共享共同组合条形码的所述图像数据和序列2.根据权利要求1所述的方法，其中组合条形码化包括使所述细胞样品的细胞与不同将因寡核苷酸子条形码组分而彼此相异的不同的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述特异性结合成员/寡核苷酸子条8.根据权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸子条形码组分进一步包括所述特异9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法进一步包括在包括单一组合条形码化12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中获得所述分区的组合条形码化的单使所述分区的组合条形码化的单细胞与和特异性结合成员/寡核苷酸子条形码的寡核苷酸子条形码组分的图像标记区域结合的一个或多个标记的寡核苷酸接触以产生标记的13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中获得所述分区的组合条形码化的单15.一种用于获得细胞样品的单细胞的关联的图像和序列数据的试剂盒，所述试剂盒3标记的寡核苷酸群体，其与所述特异性结合成员/寡核苷酸子条形码的寡核苷酸子条4[0002]当前技术允许通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自单个细胞的poly(A)Rhapsody™单细胞分析系统对mRNA转录物和蛋白质进行定量（QuantitationofmRNATranscriptsandProteinsUsingtheBDRhapsody™Single_CellAnalysis一种剖析单细胞中蛋白质的方法。在Abseq中，通常的荧光团标记抗体被核酸序列标签替等人，“Abseq：利用液滴微流体条形码化进行超高通量单细胞蛋白质剖析（Abseq:Ultrahigh_throughputsinglecellproteinprofilingwithdropletmicrofluidic大规模平行NGS数据关联起来是非常期望的。本发明人不知道将单细胞成像数据与来自同这并不能提供与细胞的NGS数据相关联的图像数据。基于板的工作流程无法提供与大规模5[0008]图2示意性地说明了根据本发明的实施例对细胞进行分割/合并ab_oligo标记以生成可以通过成像读取的单细胞索引以及下[0009]图3提供了根据本发明的实施例使用循环免疫荧光解码单个细胞的ab_oligo标识6[0017]核酸可以包括修饰的骨架和/或修饰的核苷内连接。修饰的骨架可以包含保留骨7修饰的核碱基可以包含其他合成以及天然的核 8用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶标包含寡核苷酸、DNA、（Thermosynechococcuselongatus）TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌元件等等)。9述的或中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围其出现的上下文中提供具体引用的数字的基叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺说，关联的图像和序列数据是包含获自同一细胞的图像数据和核酸序列数据二者的数据[0041]该方法的实施例包含用特异性结合成员/寡核苷酸子条形码将细胞样品的细胞组形码的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码附接至该细胞的表面，该附接的方式使得该特异性结合成员/寡核苷酸子条形码在本发明的方法下在该细胞所经历的条件期间不会与该用将特异性结合成员/寡核苷酸子条形码的独特组合与给定细胞缔合的组合方案来将子条形码的独特组合与细胞稳定缔合，其中独特组合获自特异性结合成员/寡核苷酸子条形码[0042]特异性结合成员/寡核苷酸子条形码为细胞提供子条形码，该子条形码共同提供独特的组合条形码。特异性结合成员/寡核苷酸子条形码包含特异性结合成员组分和寡核[0043]本发明实施例中采用的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码的特异性结合成员组述具有针对彼此的结合特异性的分子对的成员。特异性结合对的成员可以是天然衍生的，此，该对的成员具有针对彼此的特异性结合的特性。特异性结合成员对的实例为抗原_抗 ℃测量相互作用的结合动力学来确定的。特异性结合成员可以变化，其中特异性结合特异性结合成员是抗体片段，例如，与聚合染料特异性结合的抗体的结合片段。如本文所些多肽基本上由全部或部分识别的免疫球蛋白基因编码。识别的免疫球蛋白基因，例如在ProteinsofImmunologicalInterest）”,E.Kabat等人，美国卫生与公众服务部，自任何生物体的天然抗体、工程化抗体或为实验、治疗或下文进一步定义的其他目的而重 2片段其结合片段。[0044]特异性结合成员/寡核苷酸子条形码可以与任何方便的细胞标记物特异性地结合成员/寡核苷酸子条形码特异性结合的普遍存在的细胞表面标记物的检查物包含但不限[0045]除了特异性结合成员组分之外，特异性结合成员/寡核苷酸子条形码还包含寡核[0046]寡核苷酸子条形码组分的图像标记区域是寡核苷酸子条形码组分的结构域或子物可以是指在给定工作流程中采用的所有特异性结合成员/寡核苷酸子条形码中通用或共况下长度范围可以为5至30个核苷酸。引物结合位点可以定位在寡核苷酸子条形码组分的特异性结合成员组分试剂缀合。接头可以是例如与特异性结合成员和/或寡核苷酸组分可以通过氨基酸如赖氨酸上的伯胺或N_末端缀合至特异性结合成员组分。市售的缀合试剂0171940中提供了关于可用于本发明的实施例的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码试剂[0052]给定的组合条形码化的细胞可以包含与其稳定缔合的一个或多个特异性结合成合并迭代使细胞样品的细胞与不同的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码顺序接触。在一此分区。将细胞分配到其中的不同区室的数量可以变化，并且在一些情况下范围为5至1,成员/寡核苷酸子条形码引入不同的区室中以产生子条形码化的细胞。可以将不同的特异性结合成员/寡核苷酸子条形码引入每个区室中，使得不同区室的细胞与引入那些区室中性结合成员/寡核苷酸子条形码的数量可以变化，在一些情况下范围为5至1,000，如5至稳定缔合的区室化的细胞可以被称为子条形[0056]在产生子条形码化的细胞之后，可以将不同区室的子条形码化的细胞组合或合组合标记工作流程可以具有任何期望的迭代次数，其中更多的迭代提供更复杂的条形码，[0058]将组合条形码化的细胞分区以产生各自具有组合条形码的分区的组合条形码化孔中描述，在公开为WO/2016/118915的PCT申请序列号PCT/US2016/014612中进一步描述，组合条形码化的细胞制备核酸序列就绪组合物，例如序列就绪文库。在一些情况下，颗粒互补序列结合以及捕获寡核苷酸子条形码组分的序列。例如，在靶核酸物质是细胞mRNA并且寡核苷酸子条形码组分包含poly(A)捕获序列的情况下，珠粒结合的核酸可以包含poly中提供具有结合的核酸的珠粒，该方案包含但不限于上文针对将细胞分区所述的那些方[0063]如上所总结的，在产生各自具有组合条形码的分区的组合条形码化的单细胞之[0065]分区的组合条形码化的单细胞可以使用任何方便的方案成像以获得分区的单细标分区的分区特异性荧光条形码并且因此获得其中存在的组合条形码化的细胞的分区特与和特异性结合成员/寡核苷酸子条形码的寡核苷酸子条形码组分的图像标记区域结合的区域杂交并且包含可检测标记的寡核苷酸。在本发明的实施例中采用的标记寡核苷酸中，开号2019/0056415；美国专利申请公开号US2020/0248263；美国专利申请公开号2020/子条形码的寡核苷酸子条形码组分的图像标记区域结合的一个或多个标记的寡核苷酸接触产生标记的分区的组合条形码化的单细胞。在标记的分区的组合条形码化的单细胞集条形码组分的第二图像结构域特异性地结合，接着图像数据的第二子集可以获自该细胞。分区特异性荧光条形码可以通过首先使给定分区与多个不同的标记的寡核苷酸接触来获得，其中多个不同的标记的寡核苷酸的子集与和分区中存在的细胞缔合的特异性结合成测剩余的结合的标记的寡核苷酸以获得该分区的荧光条形码，其中检测方案可以是迭代的比率接触，使得每个不同的靶标可以与包括具有其自身独特的UMI的核酸的不同的细胞裂解缓冲液来裂解颗粒，该细胞裂解缓冲液包括去污剂（例如，SDS、十二烷基硫酸锂、4%、5%、6%或7%或更多。裂解缓冲液中去污剂的浓度可以是至多约0.0001%、0.0005%、400000、500000、600000或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包括至多约分子可以与探针杂交并被逆转录。寡核苷酸的oligo(dT)部分可以充当cDNA分子的第一链细胞标记结构域核酸还可以与和组合条形码化的细胞缔合的特异性结合成员/寡核苷酸子细胞标记结构域核酸可以充当使用寡核苷酸子条形码作为模板进行逆转录的引物，例如，合成的第一链cDNA或合成的双链cDNA构成的产物组合物与获自一个或多个另外的样品例部或一部分的互补序列。缔合RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是oligo(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。开的方法可以包括进行至少约扩增反应可以包括扩增多个核酸的0中的任何两个之间的范围或数字。该方法可以进一步包括进行一个或多个cDNA合成反应，RNA靶标的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导DNA合成和转录的多个循环；切酶的寡核苷酸驱动扩增；其中引物与核酸序列杂交并且所产生的双链体在延伸反应和扩增之前被裂解的扩增方法；使用缺乏5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增；滚环个或多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于将产物鉴定为扩增反应中的特定循环或时间点。用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增附接至珠粒的分子。第二轮PCR可以使用侧接Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引以基团或修饰的碱基可以用于促进其从固体支持物的去除。例如，酶可以用于从底物去除核聚物加尾的，以便在底物上使用oligo(dT)探针生成用于桥接扩增的相容端。在桥接扩增一引物通过添加核苷酸沿正向延伸以形成由模板分子和新形成的与模板互补的DNA链组成生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子的一端分别经由第一和第二引物附接至颗粒表增可以包括标记的核酸的指数扩增。标记的核酸的扩增可以包括标记的核酸的线性扩增。实例包含但不限于多重置换扩增（MDA）、转录介导的扩增（TMA）、基于核酸序列的扩增包含：用于扩增DNA或RNA靶标的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导DNA合用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动扩增；其中引物与核酸序列杂交并且所产生的双链体在延伸反应和扩增之前被裂解的扩增方法；使用缺乏5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链[0090]扩增可以进一步包括将一个或多个对照核酸添加到包括多种核酸的一个或多个个或多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于将产物鉴定为扩增反应中的特定循环或时间点。个核苷酸或这些值中的任何两个之间的数字或与包含poly(T)区和标记区的多个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产的扩增子组合物）经受测序方案，如NGS方案。该方案可以在任何合适的NGS测序平台上进和/或NextSeq™测序系统IonTorrent™（例如，IonPGM™和/或IonProton™测序系GSJunior测序系统或任何其他目标测序平台。NGS方案将根据所采用的特定NGS测序系采用的寡核苷酸标记的细胞组分结合试剂包含与细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸偶联记的细胞组分结合试剂的进一步细节可见于美国公开的专利申请号US20180267036和的分区，并且因此源自当获得该分区的图像数据时存在于该分区中的组合条形码化的细[0101]通过使用从中获得图像和序列数据的组合条形码化的细胞的组合条形码来关联获自相同的组合条形码化的细胞的寡核苷酸子条形码的序列读段共享相同的细胞标记，区特异性荧光条形码可以用于确定与该组合条形码化的细胞相关联的不同图像标记区域[0104]本发明的方面进一步包含可用于实践本发明方法的各种实施例的试剂盒和组合成员/寡核苷酸子条形码的寡核苷酸子条形码组分的图像标记区域结合的标记的寡核苷酸