CN119404254A 用于组装多核苷酸序列的基于k-mer的方法 （因美纳有限公司）

2024.12.18PCT/US2024/0188152024.03.07WO2024/191730EN2024.09.19公开了一种用于使用k_mer图方法进行多核器和被配置为存储该参考基因组和该样品的存储设备。该处理器可被配置为执行该方法的步2提供包括读段对的群集的流动池，其中每个读段对包含两个序列读段将每个读段对中的序列读段取向为与所述多核苷酸的所述参考指导处于从所取向的序列读段生成包括节点和边的至少一个k_mer图，其中所述至少一通过追踪穿过所述至少一个k_mer图的多个无环路径来组装所述多核苷酸的所述核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中组装所述多核苷酸的所述核苷酸序列包括确定通3.根据权利要求1或2所述的方法，其中具有所述最高总和的无环路径作为用于组装所述核苷4.根据权利要求2所述的方法，其中组装所述核苷酸序列包括通过5.根据权利要求4所述的方法，其中组装所述核苷酸6.根据权利要求5所述的方法，其中追踪所述反向路径包括在无环路径中选择最终节7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中组装所包括通过所述至少一个k_mer图的每个无环路径10.根据权利要求1所述的方法，其中生成所述至少一个k_mer图包括生成多个k_mer11.根据权利要求10所述的方法，其中生成所述至少一个k_mer图包括生成大于100个13.根据权利要求1或2所述的方法，其中组装所述多核苷酸的所述核苷酸序列包括追踪通过所述至少一个k_mer图的无环k_mer处理器，所述处理器被配置为执行机器可读指令，所述机器可读指15.一种存储包括指令的多核苷酸序列分析程序的非暂态计算机可读介质，所述指令在由处理器执行时使多核苷酸测序装置执行根据权利要3[0002]本申请要求2023年3月10日提交的美国临时申请号63/489,606的优先权，该临时[0004]识别DNA中引起疾病的突变一直是遗传医学的长期目标。基因组变体可以是患者DNA序列的小变化或更大的缺失和重复。现有的测序技术相对擅长于检测单核苷酸多态性将样品分段成多个较短序列，并将较短序列与参考基因组比对以识别逐渐变长的k_mer系列。重路径。此类实施方案可以改进依赖于贪婪路径提取来组装k_mer图或者甚至依赖于具有规程聚焦于本地信息而不是所有可用数据。贪婪规程对k_mer图上的一个路径作出的选择可取决于贪婪规程已在上游作出的选择，这可以使误差复合并且导致组装中的较低置信找到在解释输入读段的最高分数方面的一个或多个全局最佳组装来4数据的读段的k_mer可以被顺序地添加到k_mer图中。实施方案还可以包括使用取向的k_mer图确定多核苷酸序列。段的取向的信息可以包括关于读段对的重叠序列的相对取向的信息。在一些实施方案中，基因组数据的读段长度范围为25bp至300[0010]本公开的实施方案还可包括用于使用BAM文件和数据结构生成具有作为k_mer的mer图。产生无环k_mer图的显著更高速率可以是不需要或不提供来自无环k_mer图的过滤对应于群集中相同序列读段的数量的权重；以及通过追踪穿过至少一个k_mer图的多个无环路径来组装多核苷酸的核苷酸序列。[0013]另一个实施方案是存储包括指令的多核苷酸序列分析程序的非暂态计算机可读附图标号或特征可结合或可不结合它们出现[0015]图1是例示通过将多核苷酸群集数据输入到k_mer组装系统并输出组装的序列数5[0020]实施方案涉及用于通过以下方式有效地确定相对长的核酸分子的序列的系统和分子中核苷酸碱基的推断序列。测序读段可以是任何合适的长度，诸如长度为约或超过约构成测序读段的给定长度k的子序列。例如，序列“AGCTCT”可被分成3个核苷酸子序列mer可以是重叠的或不重叠的。[0021]序列比较可包括一个或多个比较步骤，其中将测序读段的一个或多个k_mer与一6和人。在一些情况下，参考序列的数据库由来自一个或多个参考个体或参考样品来源(例[0026]具有或不具有指派权重的k_mer的集合可以用于生物信息学分析中的许多任务，装以及决定通过k_mer图的许多节点采取什么路径来构造特定的K+1长度序列些实施方案中，可以通过对与边所暗示的序列精确匹配的读段进行计数来计算边的权重。的最高数量的读段对的图的边将比具有包含与对应于边的k_mer的精确匹配的较低数量的7[0028]在一些实施方案中，从参考基因组拷贝的指导序列在指派对应边权重时不被计[0029]一般来讲，将读段中的k_mer与参考序列进行比较包括对读段和参考序列中匹配组序列中出现多少次、以及特定k_mer在参考序列数据库中的所有参考序列中出现多少次度。在将测序读段与参考序列进行比较之前，可计算数据库中每个k_mer和参考序列的k_应的组装群集。在一些实施方案中，人工突变可以帮助将短读段组装成更长的读段/重叠8NGS技术首先在流动池上产生寡核苷酸序列的测序群集，然后通过NGS系统读取该测序群[0038]例如，长靶多核苷酸(诸如基因组序列的片段)可以使用如PCT公布WO2021/NGS技术确定每个组装群集内的正向和反向链对的核苷酸序列。过使用参考指导序列，可以将序列读段最初指派给沿着推定的参考指导多核苷酸的位置。则可以构建具有不同k_mer大小的多个k_mer图。一旦针对特定k_mer大小构建了令人满意两个相邻节点中的两个k_mer彼此相同，除了一个k_mer的第一个碱基和下一个k_mer的最该相同k_mer序列已经由单个碱基扩展以产生对应于k_mer图中的相邻节点的另一个k_将比具有更少的相同读段对的组装群集中的边具有更大的边权重。一旦k_mer组装系统计9连续长读段序列。[0043]使用纳米孔对双链多核苷酸进行测序的某些实施方案和/或分析或组织与k一mer多核苷酸相关的信号的某些实施方案可以使用2021年9月22日提交的美国临时专利申请序列号63/247,155和2021年10月7日作为US2021/0313009公布的美国专利申请序列号17/[0045]本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员和WO94/24144，以及Fasman(“PracticalHandbookofBiochemistryandMolecular团，并且在一些示例中还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基磷酸胞苷(CTP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷脱氧胸苷(dTTP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、单磷酸脱氧鸟苷于例如NarayanP等人(1987)MolCellBiol7(4):1572_5；HorowitzS等人(1984)ProcAmChemSoc.127(5):1424_30；Johnson等人(2004)32(6):1937_41；NucleicAcidsRes.35(16):5360_9；A和吡啶基取代(Wettig等人(2003)JInorgBiochem94:94_99；Clever等人(2005)AngewChemIntEd117:7370_7374；Schlegel等人(2009)OrgBiomolChem7(3):476_82；Zimmerman等人(2004)BioorgChem32(1):13_25；Yanagida等人(2007)NucleicAcids(1985)InorgBiochem25:61_73；Ono等人(2004)AngewChem43:4300_4302；Lee等人核苷(或经修饰的脱氧核糖核苷)、嘧啶二聚体的分子。多核苷酸为聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包括脱氧核糖核酸的示例：基因或基因片段(例如探针、引物、表达的序列标签(EST)或基因表达系列分析可用于在描述包括若干多核苷酸种类的特定方法或组合物时区分一种多核苷酸种类与另现的序列。诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)；昆虫，诸如黑腹果蝇(Drosophila孢子虫(Pneumocystiscarinii)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、酵母、酿酒酵母肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌属(staphylococci)或肺炎支原体(Mycoplasma[0065]模板/靶多核苷酸链的群体或其扩增子可具有对特定测序装置来说期望或合适的000,000个核苷酸。靶多核苷酸链的群体或其扩增子的平均链长可在介于上述最大值与最酸链的最大链长和最小链长可在介于上述最大值与最小值之间的对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对(或碱基对概率)的推断序列。典型的测序实验可以是指对潜在k_mer序列采样的k_mer图上的随机游走。在k_mer图中，节点可以表示k_[0086]子图BAM文件是来自NGS过程的序列群集的文件中涉及的所有读段的坐标分类BAM群集的子集及其相关的BAM文件(例如，每个BAM文件)创建到数百个单独的k_mer子图中来[0087]在一些实施方案中，方法可将例如数百万个群集和/或集合的总体测序问题分成上的RAM。本公开的实施方案可以有利地对组装大小进行子集化以适合典型的计算机硬件存储在子图链接文件114中的重叠的类似读段对之间创建链接。子图链接文件存储一对读每一者的取向信息。该信息可用于确定给定读段对是否与其链接的读段对处于正确的取[0092]为了构建联合查找数据结构，可以用等于最大读段ID的长度来初始化代表性向得与群集相关联的所有链接读段对可以以与正在组装的单个靶序列相同考基因组确定链接读段对的一些估计比对或无估[0095]在生成用于给定群集的参考指导时，组装系统可以迭代通过相关联的读段和群集相关联的MUT读段的参考分类映射的BAM文件。该步骤124可以迭代通过来自群集的所有[0097]如果为参考指导提供了取向信息，则在该步骤124期间还可以相应地更新读段和对于群集的代表并且相对于BAM文件中指示的取向来比较和取向。对于属于给定对的给定[0101]该过程的输出可以是包含与通过质量阈值的群集相关联以与参考基因组比对，并且可以确定来自群集的读段对与参考基因组的相关程度的量度。如，这可能意味着如果特定k_mer在单个子序列中出现多次，则其可能仅被认为是非唯一[0105]在一些实施方案中，图构造可以从用于构造k_mer图的主干的来自参考指导的k_指导k_mer对于在给定k_mer长度下成功的图构造是唯一的。输出可以是具有最低k_mer长[0108]如上所述，组装系统可以使用不同大小的k_mer来构建测试图以确定其中没有循[0109]k_mer图中的边是对图中相关节点处来自寡核苷酸的特定k+1个核苷酸的支持的于最重路径提取的示例函数可通过首先对k_mer图执行正向传递路径评分来如下操作。每个可能路径的权重可以被定义为路径的边权重之和，其可以用于确定最重的可能正向路[0112]这些步骤128或130的输入可以是在先前步骤期间生成的k_mer图，如果图构造成佳权重值严格大于已经找到的当前全局最佳权重(许对边权重做出贡献，因此此类实施方案可以确保路径的头部和尾部将不包含仅参考节该路径并且计算k_mer以确定当遍历该路径时与每个节点相关联的序列。如果到达具有进ASCII编码的偏移：qualityValue＝min(maxEdgeWeight>0？20+2*(maxEdgeWeight_1):0,[0119]本公开的一个方面涉及用于k_mer图构造的方法和应用。在一些实施方案中，k_边权重来从k_mer图产生序列。给定节点的节点路径的最佳可能评分以及该追踪是从节点的顶部还是底部还是底部来进根据本公开的方法可以提供包括序列和置信度评分的信息，该信息可以作为组装序列输[0126]然后该组装的序列或重叠群可用作在框134处输出的结果的一部分。该序列然后的每个群集的取向读段或来自失败的图构造的每个群集140的取向参考指导有关的数据。应当认识到，如果图构造过程在框126处失败，则过程100可以直接移动以输出文件138、[0128]本公开的实施方案还可包括用于分析和组装多核苷酸序列的系统。图2是可以与本文所公开的测序和组装方法来确定DNA序列。图2所描绘的计算系统200的一般架构包括计算机硬件和软件部件的布置。计算系统200可包括比图2所示的那些更多(或更少)的元经由网络从其他计算系统或服务接收信息和指令。处理单元210还可与存储器270进行通[0130]存储器270可包含处理单元210执行以便实施一个或多个实施方案的计算机程序算机程序指令以供处理单元210在计算设备200的一般管理和操作中使用。存储器270还可过程。此外，存储器270可包括数据存储库290和/或一个或多个其他数据存储库或与其通或多个输出和/或一个或多个结果(包括中间结果)。这样的数据可包括例如未突变的序列析特征和序列数据存储信息转移或分布到云计算环境或基于云的网络的方法。与测序数[0134]在一些实施方案中，所述方法可用各种合适的编程语言中的任一种编程语言编现的数据分析软件)中。包括如本文所述的计算机的实现的方法的软件直接安装到计算机算机或膝上型计算机与一个或多个计算机可读存储介质或设备和/或输出设备操作地通式计算机和/或膝上型计算机和/或服务器系统还可以提供用于创建或修改实验定义和/或检索包括用于执行和实现如本文所述的计算方法的计算机代码的计算机实现的软件程序、质用于存储和/或检索包括用于执行和实现如本文所述的计算方法的计算机代码的计算机[0139]在一些实施方案中，用于存储和/或检索包含用于执行和实现如本文所述的计算CONDOR框架(威斯康星大学麦迪逊分校)和通过UnitedDevices可获得的系统是为了处理中，工作流模块可以是参照指导组装模块并且可以集成到NGS序列分析平台中，例如来自令人满意的图(例如，包含循环或太多非唯一k_mer[0143]在一些实施方式中，k_mer图组装系统可以使用群集信息来提取每个单独组装群集的比对的M