分子生物学常用技术下

分子生物学常用技术（下）研究生及本科生分子生物学实验教学Contents课程目录分子生物学常用技术体系全景导览，涵盖核酸、蛋白质与细胞层面的核心实验方法。01PCR技术进阶：从定性到精确定量02CRISPR/Cas9基因编辑技术03蛋白质研究核心技术体系04核酸分析与表观遗传学方法05细胞学相关实验技术06技术整合与应用展望CHAPTER01PCR技术进阶从定性检测到精确定量分析的技术演进MOLECULARBIOLOGY·TECHNIQUESRT-PCR：逆转录聚合酶链式反应RT-PCR通过逆转录酶将不稳定的RNA转化为cDNA后再进行PCR扩增，是研究基因表达水平的核心技术。其关键在于逆转录引物的选择策略和RNA质量的严格控制，这两点直接决定了后续定量结果的可靠性。RT-PCR实验操作：移液器与PCR管01核心原理：利用逆转录酶以RNA为模板合成cDNA第一链，再以cDNA为模板进行PCR扩增，实现从RNA到DNA的信息转移02引物策略：Oligo(dT)捕获mRNA，随机六聚体逆转录全部RNA，基因特异性引物针对单一靶标03质量控制：DEPC水处理防RNase污染，A260/A280控制在1.8–2.0，凝胶电泳验证28S/18S条带04应用场景：基因表达差异分析、RNA病毒载量检测、cDNA文库构建及mRNA剪接变体鉴定MolecularBiologyTechniques实时荧光定量PCR（qPCR）qPCR通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号变化，实现了对核酸模板的精确定量分析。Ct值与起始模板量的对数呈线性反比关系，结合内参基因校正的2^(-ΔΔCt)方法已成为基因表达相对定量的行业标准。荧光化学体系SYBRGREENI非特异性嵌入双链DNA发出荧光，成本低、操作简便，但需通过熔解曲线验证扩增特异性TAQMANPROBE利用5'端荧光基团与3'端淬灭基团的FRET效应，仅当探针被Taq酶水解时才发出荧光，特异性显著优于染料法数据分析方法CTVALUE荧光信号达到设定阈值时所经历的PCR循环数，与起始模板量的对数呈严格线性反比关系2(-ΔΔCT)METHOD先用内参基因（如GAPDH、β-actin）校正样本间差异，再与对照组比较得出基因表达的倍数变化FLUORESCENCESYSTEMSqPCR荧光体系多维对比SYBRGreen染料法和TaqMan探针法各有适用场景：前者以低成本和操作简便见长，适合大批量基因表达筛查；后者以高特异性和多重检测能力取胜，更适合临床诊断和精细分析。SYBRGreenI染料非特异性结合所有双链DNA，成本低、操作简便，适合大批量基因表达筛查与初步验证实验。TaqMan探针序列特异性荧光探针标记，灵敏度与特异性均更优，适合临床诊断、SNP分型与多重靶标检测。SYBRGreenvsTaqMan五维能力对比SYBRGreen成本与简便性领先，TaqMan在特异性和多重检测上优势明显CHAPTER02CRISPR/Cas9基因编辑技术从细菌免疫机制到精准基因组编辑的革命性工具MolecularBiology·Chapter04CRISPR/Cas9系统工作原理CRISPR/Cas9基因编辑系统的核心是sgRNA引导Cas9核酸酶精准识别并切割靶基因组位点，产生双链断裂后，细胞通过NHEJ（非同源末端连接）或HDR（同源定向修复）两种途径完成修复，分别实现基因敲除与精确编辑。CRISPR/Cas9基因编辑系统分子结构模型01系统由两个核心组分构成：Cas9核酸酶负责切割DNA双链，sgRNA（单链向导RNA）包含20nt导向序列负责精准识别靶位点02PAM序列（SpCas9为NGG）是Cas9识别与切割的必要条件，位于靶序列3'端下游，无PAM则Cas9无法结合和切割03NHEJ修复途径易产生随机Indel突变，导致移码和提前终止密码子，是实现基因敲除（Knockout）的主要策略04HDR修复途径需同时提供含同源臂的供体模板，可实现精确的基因插入、点突变纠正和报告基因敲入（Knockin）CRISPR·sgRNADesignsgRNA设计策略与脱靶控制sgRNA的设计质量是CRISPR实验成败的关键。合理的GC含量、严格的特异性评估、以及对脱靶效应的系统性控制策略，是确保基因编辑精确性和可靠性的三大核心要素。GC含量与序列优化GC含量控制在40%-60%之间，避免连续4个以上相同碱基的重复序列，5'端前4-6个碱基对靶标识别特异性影响最大。40%–60%全基因组脱靶预测利用Cas-OFFinder、CRISPOR等在线工具全基因组范围预测潜在脱靶位点，优先选择脱靶评分高、错配位点少的sgRNA序列。CRISPOR高保真Cas9变体SpCas9-HF1、eSpCas9通过削弱非特异性DNA相互作用，可将脱靶率降低10-100倍而不显著损失切割活性。10–100×Cas9n切口酶策略需设计两条相邻sgRNA分别切割互补链，产生交错双链断裂，使脱靶概率降至单sgRNA策略的平方级。平方级ApplicationsOverviewCRISPR/Cas9技术应用全景CRISPR/Cas9技术已从基础研究工具发展为贯穿基因功能研究、疾病模型构建和临床治疗探索的全方位平台。基因功能研究通过NHEJ途径实现基因敲除，观察缺失表型推断基因功能，已成为功能基因组学研究的标准方法。CRISPR筛选技术（sgRNA文库）可同时对数千个基因进行高通量功能筛选，识别药物靶点和耐药机制。sgRNA文库精准基因编辑利用HDR途径在特定位点插入荧光蛋白标签（如GFP），实现内源蛋白的活细胞动态追踪。碱基编辑器（BaseEditor）无需双链断裂即可实现C→T或A→G的单碱基精确转换，适用于点突变疾病模型的构建。BaseEditor动物模型构建将Cas9mRNA与sgRNA显微注射至受精卵，可在一代内获得基因编辑小鼠，周期从传统的1-2年缩短至2-3个月。多重sgRNA共注射策略可在同一胚胎中同时敲除多个基因，构建多基因突变的复杂疾病模型。2-3个月CHAPTER03蛋白质研究核心技术体系从蛋白表达定量到相互作用网络的系统研究方法MolecularBiology·ProtocolWesternBlot蛋白质免疫印迹技术WesternBlot通过SDS分离蛋白质、转膜后利用特异性抗体进行免疫检测，是验证目标蛋白表达水平变化最可靠的方法。其结果的可靠性取决于样品制备的标准化程度、抗体的特异性验证以及内参蛋白的合理选择。样品制备：含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液，BCA或Bradford法定量后统一上样量（20–50μg/泳道），确保组间可比性SDS电泳：SDS使蛋白带均匀负电荷并按分子量分离，浓缩胶pH6.8浓缩样品、分离胶pH8.8按大小分离转膜与验证：湿转或半干转法转移至PVDF膜（需甲醇活化）或NC膜，丽春红/PonceauS染色快速验证转膜效率抗体孵育与成像：封闭→一抗4°C过夜→HRP二抗室温1h，ECL化学发光成像检测信号WesternBlot凝胶成像结果示意TroubleshootingGuideWesternBlot常见问题与排查策略WesternBlot实验中的问题主要源于样品质量、抗体特异性和操作细节三个环节。系统化的排查思路能帮助快速定位问题根因，从样品制备、电泳条件到抗体优化逐环节排除，是获得可靠结果的必要素养。WesternBlot典型问题诊断表常见问题可能原因解决方案无信号或信号极弱抗体效价低/蛋白上样量不足/转膜不完全优化抗体稀释比例；增加上样量至50μg；用丽春红验证转膜效率非特异性条带多封闭不充分/一抗交叉反应/二抗浓度过高延长封闭时间至2h；更换经过验证的高特异性抗体；降低二抗浓度条带弥散或拖尾蛋白降解/电泳电压过高/凝胶浓度不合适全程冰上操作并加入新鲜蛋白酶抑制剂；降低电泳电压至80-120V内参条带不一致上样量不均/内参抗体选择不当严格BCA定量后等量上样；验证内参在处理条件下表达稳定性覆盖WesternBlot四大常见问题及对应排查方案MolecularBiologyTechniques蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用研究是解析信号通路和分子机制的核心手段。酵母双杂交适合大规模筛选互作蛋白，免疫共沉淀能验证天然状态下的体内互作关系，Pull-down实验则提供体外直接相互作用的证据，三者组合使用构成完整的互作验证体系。酵母双杂交系统利用转录因子Gal4的DNA结合域和激活域分离后失去转录活性的原理，当互作蛋白使两域重新接近时激活报告基因表达适用于大规模筛选cDNA文库中的未知互作蛋白，但需注意假阳性问题，阳性克隆需通过Co-IP等独立方法验证大规模筛选免疫共沉淀（Co-IP）利用特异性抗体从细胞裂解液中沉淀目标蛋白及其天然互作复合物，最能反映生理条件下的体内蛋白互作关系关键控制：设置IgG阴性对照排除非特异性吸附，使用温和裂解液保持蛋白复合物完整性体内验证GSTPull-down将目标蛋白与GST标签融合表达后固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，与候选蛋白孵育后验证是否存在直接物理相互作用体外实验系统，可排除间接互作干扰，是确认两个蛋白直接结合的关键验证手段直接结合PROTEOMICS·TECHNIQUES蛋白质组学研究技术路线蛋白质组学从整体层面系统分析细胞或组织中全部蛋白质的表达谱和修饰状态。传统双向电泳-质谱路线直观可靠，适合差异蛋白发现；现代LC-MS/MS鸟枪法以高通量和高灵敏度成为主流，结合生物信息学数据库搜索实现大规模蛋白鉴定。双向电泳（2-DE）第一向等电聚焦按蛋白等电点（pI）分离，第二向SDS按分子量分离，差异蛋白点经染色后切取用于质谱鉴定pI+MW二维分离MALDI-TOF质谱通过肽质量指纹图谱（PMF）快速鉴定蛋白：将蛋白酶解后的肽段质量与数据库中理论酶切谱比对，匹配度最高的即为候选蛋白PMF肽质量指纹图谱LC-MS/MS鸟枪法蛋白混合物经胰蛋白酶消化后直接上液相色谱分离，串联质谱采集肽段序列信息，通过Mascot等搜索引擎比对NCBI或UniProt数据库高通量主流策略定量蛋白质组学TMT/iTRAQ同位素标记和DIA（数据非依赖采集）策略可同时定量数千种蛋白，适用于临床样本的大规模比较分析TMT/iTRAQ/DIAProteinExpression&Purification重组蛋白的原核表达与分离纯化大肠杆菌原核表达系统是获得重组蛋白最经济高效的途径。通过融合亲和标签实现一步亲和纯化，再串联离子交换和分子筛层析可获得高纯度蛋白。01表达载体选择：pET系列载体在T7启动子驱动下可实现高水平诱导表达，IPTG浓度（0.1-1mM）和诱导温度（16-37°C）需根据蛋白溶解性优化02镍离子亲和层析：His标签蛋白与Ni²⁺螯合树脂特异性结合，低浓度咪唑（20-40mM）洗涤去杂蛋白，高浓度咪唑（250-500mM）竞争洗脱目标蛋白03离子交换层析：DEAE阴离子交换柱适用于酸性蛋白纯化，通过逐步增加NaCl浓度梯度洗脱，按蛋白表面电荷差异实现进一步分离04凝胶过滤层析：按蛋白分子大小和流体动力学半径分离，是最后一步精纯手段，同时可评估蛋白的寡聚状态和分子量蛋白纯化层析实验—AKTA系统与层析柱CHAPTER04核酸分析与表观遗传学方法从序列测定到表观修饰的多维度基因组解析技术SEQUECINGTECHNOLOGY基因测序技术演进与应用基因测序技术经历了从Sanger法到二代高通量测序再到三代单分子测序的三次革命。NGS以超高通量和低成本成为当前主流，而三代长读长测序在基因组组装和表观修饰直接检测方面补齐了短读长的固有短板，两者互补构成了现代基因组研究的完整技术体系。FIRSTGENERATIONSanger测序基于双脱氧核苷酸随机终止DNA链延伸原理，至今仍是克隆验证和突变确认的金标准800–1000bpSECONDGENERATIONIlluminaNGS基于可逆终止子边合成边测序，单次运行可产出6Tb数据，约200亿条reads≈$600THIRDGENERATION三代单分子测序PacBioSMRT与Nanopore实现超长读长，可直接检测DNA甲基化修饰，适合复杂基因组从头组装~Mb级读长CLINICALAPPLICATION临床应用肿瘤靶向用药Panel检测、无创产前筛查、遗传病全外显子组测序和病原体宏基因组鉴定NIPT·Panel·WESSequencingTechnology三代测序技术关键指标对比三代测序技术各有鲜明特征：Sanger法适用于小规模验证，NGS主导大规模测序应用，三代长读长技术在基因组组装中不可替代。Sanger（一代）高准确率、读长900bp，通量仅0.001Gb，适合小规模验证与金标准校验Illumina（二代）读长150bp但通量达6,000Gb、成本仅$5/Gb，主导大规模测序应用PacBio/Nanopore（三代）读长20,000bp领先数个数量级，基因组组装与结构变异检测不可替代三代测序技术核心指标对比数据来源：公开文献综合整理·各指标量级差异显著，纵轴采用对数刻度MicroarrayTechnology基因芯片（DNA微阵列）技术基因芯片通过将数万条DNA探针高密度固定于固相载体上，利用核酸杂交原理实现对全基因组表达谱或基因型变异的高通量平行检测。虽然NGS在分辨率上更具优势，但芯片凭借标准化流程和成熟的分析体系，仍是大样本临床队列研究的重要工具。基本原理将荧光标记的cDNA/cRNA样本与芯片上固定的寡核苷酸探针进行杂交，通过扫描各位点荧光强度定量基因表达水平或检测SNP基因型表达谱芯片可同时检测2–5万个基因的mRNA丰度，通过聚类分析识别共表达基因模块，揭示疾病相关的基因调控网络SNP芯片利用等位基因特异性探针区分纯合与杂合基因型，广泛用于全基因组关联分析（GWAS），已成功鉴定数千个疾病易感位点技术对比与RNA-Seq相比，芯片无需复杂的文库制备和生物信息学分析流程，但受限于预设探针只能检测已知序列，无法发现新转录本Epigenetics·DetectionMethodsDNA甲基化分析技术DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一，CpG岛的异常甲基化与肿瘤发生、发育调控和衰老密切相关。重亚硫酸盐处理结合PCR测序是目前单碱基分辨率检测甲基化状态的金标准方法。重亚硫酸盐测序（BSP）亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶脱氨转化为尿嘧啶，甲基化的C保持不变，PCR扩增后测序精确判定每个CpG位点状态单碱基分辨率·定量准确·适用于小区域精细分析BSP·GoldStandard甲基化特异性PCR（MSP）设计两对引物分别识别甲基化和未甲基化序列，通过普通PCR快速判断目标启动子区域的甲基化状态操作简便·成本低·适合临床大规模筛查ClinicalScreening生物学意义CpG岛甲基化通常抑制基因转录，抑癌基因启动子异常高甲基化是基因沉默的重要机制，已成为肿瘤早期诊断标志物调控基因表达·维持基因组稳定·参与发育调控Biomarker全基因组甲基化分析基于Illumina甲基化芯片可同时检测85万个CpG位点，适用于大规模表观基因组关联分析（EWAS）高通量检测·覆盖全基因组·发现新的甲基化标志物850KCpGTranscriptionalRegulation转录调控机制研究技术转录调控研究旨在解析转录因子如何识别并结合靶基因的顺式调控元件，从而精确控制基因表达的时空模式。ChIP技术能捕获体内蛋白-DNA相互作用的真实快照，报告基因系统则提供启动子活性的定量读数，两者结合构成转录调控研究的完整技术框架。ChIP-Seq技术流程甲醛交联固定蛋白-DNA超声打断200–500bp抗体沉淀特异性抗体高通量测序ChIP-Seq报告基因分析流程克隆构建启动子→Luc载体细胞转染导入报告载体活性检测发光强度定量突变定位核心元件鉴定输出→全基因组结合位点图谱+核心顺式调控元件01染色质免疫共沉淀（ChIP）甲醛交联固定蛋白-DNA相互作用后超声打断染色质至200–500bp片段，用特异性抗体沉淀目标转录因子及其结合的DNAChIP-Seq将沉淀的DNA片段进行高通量测序，在全基因组范围绘制转录因子结合位点图谱和组蛋白修饰分布图谱02报告基因活性分析将候选启动子序列克隆至荧光素酶（Luciferase）报告载体上游，转染细胞后检测发光强度定量启动子转录活性通过截短突变和定点突变策略逐步缩小关键调控区域，精确定位启动子中介导转录调控的核心顺式作用元件MOLECULARBIOLOGYRNA干扰（RNAi）技术RNA干扰通过小分子RNA引导RISC复合体特异性降解靶mRNA，siRNA适合短期快速实验，shRNA载体可实现长期稳定敲低，需关注脱靶控制与效率验证。01🔬分子机制双链siRNA被Dicer加工后装载进RISC复合体，引导链与靶mRNA互补配对，Argonaute2蛋白在配对区中部切割mRNA导致其降解。这一过程具有高度序列特异性，是基因功能研究的核心工具。02⚗️化学合成siRNA21-23nt双链RNA直接脂质体转染，转染后24-72h敲低效率最高，效果持续3-5天，适合快速功能筛查和剂量-效应实验。操作简便、周期短，是体外实验的首选方案。03🧬shRNA慢病毒载体短发夹RNA通过慢病毒感染整合入基因组，经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系，可实现数周至数月的持续基因沉默。适用于长期观察、药物筛选及难转染细胞的基因操作。04✓脱靶控制至少使用3条靶向同一基因不同区域的独立序列，若均产生一致表型可排除脱靶效应；同时需设scramble阴性对照。结合qPCR验证敲低效率，确保实验结果的可靠性。CHAPTER05细胞学相关实验技术从细胞培养到功能表型分析的系统实验方法CELLPROLIFERATION细胞增殖检测方法比较细胞增殖检测是评估基因功能、药物敏感性和细胞活力的核心实验。MTT法经典可靠但操作繁琐，CCK-8法水溶性好且无需溶解步骤成为主流选择，BrdU法则通过直接标记DNA合成精确定量S期细胞比例，三种方法各有适用场景。MTT法线粒体琥珀酸脱氢酶将黄色MTT还原为紫色甲瓒结晶，DMSO溶解后测490nm吸光度，间接反映活细胞数量，但甲瓒不溶于水需额外溶解步骤。490nm检测波长CCK-8法WST-8试剂被细胞内脱氢酶还原为水溶性橙色甲瓒产物，直接测450nm吸光度，无需溶解步骤且对细胞毒性更低，适合长时间连续监测。450nm检测波长BrdU标记BrdU在DNA合成期（S期）替代胸腺嘧啶掺入新合成DNA，通过抗BrdU抗体免疫荧光或流式检测，可精确定量处于增殖状态的细胞比例。S期精确定量细胞周期分析结合PI染色进行细胞周期分析，可同时获得G0/G1、S、G2/M各期细胞百分比，比单纯比色法提供更详细的增殖动力学信息。G0–M全周期覆盖CELLMIGRATION&INVASION细胞迁移与侵袭实验技术细胞迁移与侵袭实验是评价肿瘤转移潜能和基因功能的关键表型分析手段。划痕实验操作简便适合初筛，Transwell迁移/侵袭实验能定量分析细胞穿越屏障的能力，两者结合可全面评估细胞的运动和侵袭特性。Transwell细胞迁移实验·结晶紫染色显微镜观察01划痕实验（伤口愈合）：在单层细胞上用无菌枪头制造线性划痕，0h和24-48h分别拍照，用ImageJ测量伤口面积变化计算迁移速率，需设丝裂霉素C对照排除增殖干扰02Transwell迁移实验：8μm孔径聚碳酸酯膜分隔上下室，细胞在上室无血清培养基中接种，下室加含10%FBS的趋化培养基，12-24h后擦去上室面细胞，结晶紫染色计数穿膜细胞03Transwell侵袭实验：在Transwell膜上室面预铺Matrigel基质胶模拟细胞外基质屏障，细胞需分泌MMP等蛋白酶降解基质后才能穿膜，更真实反映体内侵袭过程04数据标准化：每个条件至少设3个复孔，随机选取5个以上视野计数，实验重复3次以上；用GraphPad进行t检验或ANOVA统计分析MolecularBiologyTechniques细胞凋亡检测技术细胞凋亡检测是评估药物疗效和基因功能的重要表型指标。AnnexinV/PI双染流式细胞术是定量分析凋亡的金标准方法，能区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞；TUNEL法和Caspase活性检测则从DNA断裂和蛋白酶激活两个维度提供补充验证。AnnexinV-FITC/PI双染流式早期凋亡细胞PS外翻暴露于膜外与AnnexinV结合（AV⁺PI⁻），晚期凋亡/坏死细胞膜完整性丧失PI可进入（AV⁺PI⁺）AV⁺PI⁻/AV⁺PI⁺TUNEL法凋亡晚期DNA被内切酶切割产生大量3'-OH末端，TdT酶将标记的dUTP连接到断裂末端实现原位检测3'-OH末端标记Caspase级联活化检测Caspase-3/7是凋亡执行的关键效应蛋白酶，其活性升高和底物PARP的切割（89kDa片段）是凋亡发生的分子标志PARP89kDa线粒体膜电位检测JC-1染料在正常线粒体中形成红色聚集体，凋亡时膜电位下降变为绿色单体，红/绿比值下降反映线粒体途径凋亡的启动JC-1红/绿比值CELLCYCLEANALYSIS细胞周期分析技术细胞周期分析通过检测细胞群体中DNA含量的分布来解析各周期阶段的细胞比例，是评估增殖状态和药物作用机制的基础实验。01PI染色流式检测乙醇固定细胞后用RNase消化RNA排除干扰，PI嵌入双链DNA后荧光强度与DNA含量成正比，G1=2N、S=2N-4N、G2/M=4N02数据拟合分析使用ModFit或FlowJo软件对DNA含量直方图进行曲线拟合，自动计算G0/G1、S、G2/M各期细胞百分比及增殖指数03BrdU/7-AAD双参数分析BrdU标记S期细胞，7-AAD标记总DNA含量，两参数散点图精确区分G1、S、G2/M期细胞，尤其适合检测S期变化04周期调控蛋白检测WesternBlot检测CyclinD1、CDK4、p21、p27等周期调控因子的表达变化，从分子水平解释周期阻滞的机制PROTEINVISUALIZATION免疫荧光与免疫组织化学技术免疫荧光和免疫组化是基于抗原-抗体特异性结合原理，在细胞和组织原位可视化蛋白表达与定位的核心技术。免疫荧光以高灵敏度和多色共染优势适用于亚细胞定位研究，免疫组化则以稳定性和可长期保存的特点成为临床病理诊断的标准方法。IMMUNOFLUORESCENCE免疫荧光（IF）●原理与检测：荧光标记二抗结合目标蛋白后在共聚焦显微镜下观察，可实现亚细胞级别的精确定位，DAPI复染细胞核提供空间参照●多色共染：使用不同种属来源的一抗搭配不同荧光素标记的二抗（如FITC/TRITC/Cy5），可在同一细胞中同时观察2-3种蛋白的共定位关系●技术优势：灵敏度高、特异性强、可实现活细胞动态成像，适用于研究蛋白相互作用和亚细胞结构动态变化IMMUNOHISTOCHEMISTRY免疫组织化学（IHC）●原理与检测：HRP标记二抗催化DAB产生棕色沉淀标记目标蛋白位置，苏木素复染细胞核，光学显微镜下即可观察，切片可长期保存用于回顾性分析●抗原修复：石蜡切片需进行热诱导抗原修复（HIER）：柠檬酸缓冲液pH6.0或EDTApH9.0微波/高压处理，暴露被甲醛交联遮蔽的抗原表位●临床应用：操作简便、成本较低、结果稳定可靠，是病理诊断中判断肿瘤来源和分型的金标准方法CHAPTER06技术整合与应用展望从单一技术到多组学整合的研究范式演进CASESTUDY典型科研案例：多技术协同解析基因功能一个完整的分子生物学研究项目通常需要5-8种技术的协同配合。从表达验证到功能表型、从蛋白互作到转录调控，多种技术形成证据链条逐步深入，最终从现象描述推进到分子机制的完整解析。表达验证与功能表型01qPCR和WesternBlot分别在mRNA和蛋白水平验证目标基因在肿瘤组织vs正常组织中的差异表达，建立研究起点02慢病毒shRNA/CRIS