CN119409745A 一种聚合度可控的透明质酸寡糖及其衍生物的制备方法 （山东大学）

一种聚合度可控的透明质酸寡糖及其衍生本发明涉及一种聚合度可控的透明质酸寡过软骨素合酶AuCS、透明质酸合酶PmHAS和软骨素裂解酶ODV_E66配合制备透明质酸寡糖及其衍合度透明质酸寡糖及其衍生物功能及特性研究合酶AuCS突变体、透明质酸合酶PmHAS突变体和软骨素裂解酶ODV_E66制备透明质酸寡糖及其衍22.权利要求1所述的透明质酸寡糖及其衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步(2)以步骤(1)所得的软骨素三糖为受体底物，UDP_GlcNAc/寡糖衍生物对应的糖供体到一系列还原端为软骨素三糖非还原端为透明质酸链的嵌所述透明质酸合酶PmHAS来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteuuellamultoci所述软骨素裂解酶ODV_E66来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa36.一种提高合成效率与收率、聚合度可控的权利要求1所述透明质酸寡糖及其衍生物1)以GlcA_pNP为起始受体底物，UDP_GalNAc为供体底物，在软骨素合酶AuCS突变体2)以软骨素二糖为受体底物，UDP_GlcA为供体底物，在软骨素合酶AuCS突变体AuCSGlcA为供体底物，在透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D247N/D249N)和Mn2+的催化下反应34)将步骤3)所得的透明质酸与软骨素嵌合体五糖或其衍生物纯所述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D517N/D519N)是将软骨素合酶AuCS氨基酸序列中第517步骤2)中，所述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D237N/D239N)是将软骨素合酶AuCS氨基酸序列中第237位与第239位的天冬氨酸突步骤3)中，所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D527N/D529N)是将透明质酸合酶PmHAS氨基酸序列中第527位与第529位的天所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D247N/D249N)是将透明质酸合酶PmHAS氨基酸2+的终浓度为10mM。述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D517N/D519N)、步骤2)中所述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D237N/D239N)、步骤3)中所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D527N/D529N)、突变体PmHAS(D247N/D249N)的添加终浓度均为1～3m所述软骨素裂解酶ODV_E66的添加终浓度为0.1～2.5m4酶水解制备透明质酸奇数寡糖的方法，该专利利用牛睾丸型透明质酸酶(BTH)和水蛭型透明质酸酶(LHase)两种水解酶制备奇数聚合度HA寡糖，但受制于牛睾丸来源受限，价格昂骨素裂解酶ODV_E66裂解掉还原端的软骨素结构即可获得任意聚合度的天然结构的透明质51为H或Na或K或NH4；R2为NHCOCH3，NHCOCF32N32CH33)22[0019](2)以步骤(1)所得的软骨素三糖为受体底物，UDP_GlcNAc/寡糖衍生物对应的糖供体和UDP_GlcA分别交替作为供体底物，在透明质酸合酶PmHAS和Mn2+的催化下反应3~[0021]根据本发明优选的，步骤(1)中，所述软骨素合酶AuCS来源于尿放线杆菌[0022]根据本发明优选的，步骤(2)中，所述寡糖衍生物对应的糖供体为UDP_GlcNTFA、6[0027]2)以软骨素二糖为受体底物，UDP_GlcA为供体底物，在软骨素合酶AuCS突变体[0032]根据本发明优选的，步骤3)中，所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D527N/D529N)是将透明质酸合酶PmHAS氨基酸序列中第527位与第529位的天冬氨酸突变为天冬酰[0033]所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D247N/D249N)是将透明质酸合酶PmHAS氨72+的终浓度为10mM。入使得所制备的寡糖或其衍生物可以很容易的通过C18分离柱一步纯化；随后不同链长的嵌合体寡糖或其衍生物经软骨素裂解酶ODV_E66裂解即可获得不同聚合度的透明质酸寡糖还提供了该透明质酸寡糖及其衍生物的制备方法，通过软骨素合酶AuCS、透明质酸合酶混杂，再配合软骨素裂解酶ODV_E66，就能够制备得到任意聚合度透明质酸寡糖或其衍生8[0051]图6位实施例3中PmHAS和PmHAS(D247N/D249N)在制备透明质酸与软骨素嵌合体七9AuCS(D237N/D239N)、透明质酸合酶PmHAS、透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D527N/委托南京金斯瑞生物股份有限公司生产。使用的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购买于南得[0067]1、分别以软骨素合酶基因AuCS，透明质酸合酶基因PmHAS和软骨素裂解酶基因ODV_E66为目的基因，以pET_28a(+)为载体质粒，构建重组载体质粒pET28a(+)_AuCS、pET28a(+)_PmHAS和pET28a(+)_ODV_E66，然后分别将重组载体质粒pET28a(+)_AuCS、pET28a(+)_PmHAS和pET28a(+)_ODV_E66通过42℃热激转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细[0068]以上重组载体质粒和重组大肠杆菌的构建均由南京金斯瑞生物科技有限公司完[0070]其中，所述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D517N/D519N)是将软骨素合酶AuCS氨基酸序列(SEQIDNO.2)中第517位与第519位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，软骨素合酶AuCS核苷酸序列(SEQIDNO.1)1549～1551bp的gat突变为aac，第1555～1557bp的gat突变为[0071]所述软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D237N/D239N)是将软骨素合酶AuCS氨基酸序列(SEQIDNO.2)中第237位与第239位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，软骨素合酶AuCS[0072]所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D527N/D529N)是将透明质酸合酶PmHAS氨PmHAS核苷酸序列(SEQIDNO.3)第1579～1581bp的gac突变为aac，第1585～1587bp的gac[0073]所述透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS(D247N/D249N)是将透明质酸合酶PmHAS氨PmHAS核苷酸序列(SEQIDNO.3)第739～741bp的gac突变为aac，第745～747bp的gat突变[0075]按照上述相同方法得到异源重组蛋白软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D517N/D519N)、软骨素合酶AuCS突变体AuCS(D237N/D239N)、透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS[0076]通过SDS_PAGE对纯化后的软骨素合酶AuCS及其突变体和透明质酸合酶PmHAS及其[0079]由图3可知，软骨素裂解酶ODV_E66异源表达和纯化成功，且相对纯度都达到了[0083]2)以软骨素三糖为受体底物，UDP_GlcNAc为供体底物，在透明质酸合酶PmHAS和[0096]3)将14.6mg步骤2)所得的嵌合体五糖溶于双[0101]实施例2提供的方法虽然成功制备得到了不同聚合度的透明质酸寡糖，但是在制PmHAS存在两个转移酶功能的结构域，在嵌合体七糖合成过程中产生的UDP与底物六糖在GlcNAc_T结构域发生酶促反应的逆反应，生成嵌合体五糖与UDP_GlcNAc，PmHAS和PmHAS(D247N/D249N)在制备透明质酸与软骨素嵌合体七糖时所得产物的HPLC色谱图如图6所示，具体阐述见文献(DengJQ,LuZ,LiuJ,etal.Heparosanoligosaccharidesynthesisusingengineeredsingle_functionglycosyltransferases[J].CatalysisScience&AuCS突变体AuCS(D517N/D519N)和Mn2+的催化下于37℃水浴锅中反应6h，HPLC检测反应进[0104]2)以软骨素二糖为受体底物，UDP_GlcA为供体底物，在软骨素合酶AuCS突变体体PmHAS(D527N/D529N)和Mn2+的催化下于37℃水浴锅中反应6h，在糖链非还原端延长一个6h，得到透明质酸与软骨素嵌合体五糖；UDP_GlcNAc与UDP_GlcA交替作为供体底物，在PmHAS(D527N/D529N)和PmHAS(D247N/D249N)交替催化下即可得到透明质酸与软骨素嵌合0.1％TFA终止反应，将体系pH调节到3.0左右。纯化之前将调好pH的反应液离心(室温，[0113]4)将18mg步骤3)所得的透明质酸与软骨素嵌合体五糖溶于双蒸水中至浓度达[0124]1)参照实施例3中步骤1)～步骤2)所述方法得到软骨素三糖；然后以软骨素三糖PmHAS(D247N/D249N)和Mn2+的催化下于37℃水浴锅中反应6h，得到透明质酸衍生物与软骨物、酶和Mn2+的添加量均如表1所示；纯化方式也与实施例2中所述方法一致，使用[0125]2)将12mg步骤1)中得到的透明质酸衍生物与软骨素嵌合体五糖溶于双蒸水中至物纯品；同理步骤1)中制备的透明质酸衍生物与软骨素嵌合体九糖可最终得到结构为GlcA_GlcNTFA_GlcA_GlcNTFA_GlcA_GlcNTFA的透明质酸六糖[0133]1)参照实施例3中步骤1)～步骤2)所述方法得到软骨素三糖。以软骨素三糖为受再以嵌合体四糖为受体底物，UDP_GlcA为供体底物，在透明质酸合酶PmHAS突变体PmHAS[0134]2)步骤1)中所得透明质酸衍生物与软骨素嵌合体寡糖经ODV_E66裂解，裂解产物嵌合体五糖经裂解最终可得结构为GlcA_GlcNAz的透明质酸二糖衍生物纯品；嵌合体七糖可最终得到结构为GlcA_GlcNAz_GlcA_GlcNAz的透明质酸四糖衍生物纯品；嵌合体九糖