CN119410584A 用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组合物 （拜奥拉米那公司）

201980041644.62019.06.19用于产生视网膜色素上皮细胞的方法和组方法包括提供贴附在包含第一层粘连蛋白胞暴露于分化培养基中15天至50天的第一时间二基质上培养重新铺板的第一细胞群体第二时间段，以获得包含RPE细胞的扩增和成熟的第二的蛋白质或蛋白质片段。可用于体外生成RPE细产生的RPE细胞以及利用此类21.用于分析包括成熟RPE细胞、RPE细胞的祖代和/或未分化干细胞的体外细胞培养物选择的一个或多个细胞表面标志物的细胞的其中所述CD140b的表达表明存在成熟RPE细2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中CD1403.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中GD2和/或CD184的表达被定量并且表4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括定量对C5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述b.将所述干细胞暴露于分化培养基中约15天至约50天的第一时间段，以获得包含RPEe.在所述第二基质上培养重新铺板的第一细胞群体第二时间段，以获得包含所述RPE9.根据权利要求7或8所述方法，其中当所述细胞的至少3b.将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细胞分312.根据权利要求11所述方法，所述方法包括对于所述最终混合物，选择对CD140b和对CD140b呈阳性并且对CD184呈阴4[0002]本公开涉及从干细胞生成视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法和组合物。使用包被如质量控制和富集)的细胞表面标志物。另外公开了利用本文所述方法和组合物生成的特聚体层粘连蛋白结构内是对其他层粘连蛋白和基底层分子以及膜结合受体具备结合活性5[0011]视网膜或视网膜色素上皮细胞(RPE)的色素层是位于感觉神经性视网膜外部为视[0012]与年龄相关的黄斑变性(AMD)是60岁以上人群严重视力丧失的主要原因，尤其是的特征是RPE损耗区域明确分界和视网膜外变性，也称为地图状萎缩(geographic[0014]任何基于多能干细胞的细胞替代疗法的关键是最终产物的纯度。从安全角度来[0016]另一种降低留存多能细胞风险的策略是建立其效率足以消除所有未分化的细胞难以通过色素沉着的图像分析和RPE标志物的细胞内染色来鉴别，因此转录分析的出现树立了从多能干细胞产生的RPE细胞的质量6[0019]本公开提供了用于培养多能干细胞以获得视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法。将[0030]2.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一和第二层粘连蛋白以约5μg/[0031]3.根据前述项中任一项所述的方法[0032]4.根据前述项中任一项所述的[0033]5.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述第一层粘连蛋白是LN_111或LN_7个细胞/cm2至约4.8×104个细胞/cm2的[0039]11.根据前述项中任一项所述的[0042]14.根据前述项中任一项所述的方法，其中激活素A[0043]15.根据前述项中任一项所述的方时间点，优选地在始于距所述暴露约5天至约7天并且终于所述解离步骤的时间的时间段[0046]18.根据项17所述的方法，其中当所述细胞的至少30优选地至少40更优选的至少80优选地至少85更优选地至少90最优选地至少95％对所述标志物呈阳[0048]20.根据前述项中任一项所述的方法，其包括定量表达选自GD2、CD184、CD10、[0049]21.根据项20所述的方法，其中当所述细胞的至少30优选地至少40更优选的至少80优选地至少85更优选地至少90最优选地至少95％对所述标志物呈阴[0051]23.根据前述项中任一项所述的8[0052]24.根据前述项中任一项所述的所述解离涉及将基本上整个群体解离为单个细[0053]25.根据前述项中任一项所述的方[0054]26.根据项1_25中任一项所述的方法，[0056]F2.将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细[0062]31.根据前述项中任一项cm2至约1.4×106个细胞/cm2的细胞[0066]35.根据项34所述的RPE细胞群体，包含至少70更优20再优选地不超过10仍更优选地不超过5最优选地不超过3％的非RPE眼区祖细再优选地少于3仍更优选地少于2甚至更优选地少于1最优选地少于0.5％的中胚[0069]38.根据项34_37中任一项所述的RPE细胞群体，包含至少70％的RPE细胞、少于9[0072]仍更优选地，其包含至少95％的RPE细胞、少于5％的非RPE眼区祖细胞以及少于[0073]最优选地，其包含至少95％的RPE细胞、少于3％的非RPE眼区祖细胞以及少于[0074]39.根据项34_38中任一项所述的RPE包括将所述RPE细胞群体的细胞注射到待治疗的患者的眼中，其中所述注射优选地向所述[0078]b.将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细[0080]42.根据项41所述的方法，其包括对于所述最终混合物，选择对CD140b、CD56、[0082]44.根据项41_43中任一项所述的方法，其包括对于所述最终混合物，选择对[0083]45.根据项41_44中任一项所述的方法，其包括对于所述最终混合物，选择对GD2和GD2和/或CD184的种或多种细胞表面达指示成熟的RPE细胞或RPE细胞的祖代的存[0094]去除所述第一细胞培养基，并将所述干细胞暴露于第二细胞培养基3天至12天的[0095]去除所述第二细胞培养基，并将所述干细胞暴露于含有生长因子为激活素A的第[0098]其中所述单一第一层粘连蛋白和所述单一第二层粘连蛋白独立地是层粘连蛋白_[0099]54.根据项53所述的方法，其中[0100]55.根据项53或54所述的[0101]56.根据项53_55中[0103]58.根据项57所述的方法，其中所述第一mL的浓度存在。至4.8x104个细胞/cm2的细胞密度铺板相对表达程度。每个点代表不同的细胞表面蛋白质，并且其沿x和y轴的位置由OV(y轴)和hES(x轴)中的正值百分比决定。y轴从0％到100增量为10％。x轴从0％到100增量为[0114]图5是一组代表性免疫染色，示出在成熟人PSC来源的RPE细胞(hPSC_RPE细胞)中[0116]图7是使用流式细胞术在hPSC_RPE分化3周后进行分选的具有CD140b阳性和阴性[0118]图9A_9F是示出在图8的三种基质上RPE、多能和神经特异性基因的基因表达分析于LN_111上的CD140b表达。第二行用于LN_111上的明场照片。第三行用于LN_521上的[0127]图12是示出hPSC_RPE细胞的色素沉着的三幅明场照片以及示出三种RPE特异性标细胞/cm2的细胞密度重新铺板到层粘连蛋白_521基质[0128]图13A和图13B是根据培养物是否在LN_111或LN_521基质上诱导，比较所得RPE培养物的流式细胞术结果的图。将RPE培养物以以下四个不同细胞密度范围重新铺板到LN_521上之后的四周进行流式细胞术：1.4x[0129]图14A_14F是根据培养物是否在LN_111或LN_521基质上诱导及其以以下四个不同[0137]图16A_16C是功能测定，证明通过跨上皮电阻(TEER)测量的单层完整性、通过能测定是对在LN_111或LN_521上诱导，在1比20和1比50的两种不同的重新铺板密度下的或LN_521上培养的RPE细胞(以7x104个细胞/cm2的细胞密度重新铺板)的视网膜下注射。还[0142]图17A_20B示出在LN_111或LN_521上培养的干细胞上在分化的第30天(时间点1)[0147]图21A_25B示出在层粘连蛋白_111或层粘连蛋白_521上分化的第30天(时间点1)[0149]图22A是CD140b基因在时间点1的条形图。图22B是CD140b基因在时间点2的条形[0155]图28：流式细胞术点阵图，比较分化30天后重新铺板或针对CD140b+CD184_或RNA测量的RPE和眼区聚簇之间的NCAM1/C[0162]图36示意性地示出使用CD140b/CD184_和CD140b+/G2_细胞的分选富集RPE细胞的旨在是需要存在指定成分/步骤并允许存在其他成分/步骤的开放式过渡短语、术语或单[0170]本申请说明书和权利要求书中的数值应理解为包括当减少到相同数量的有效数一起形成的蛋白质。此术语应解释为涵盖来自天然存在的来源的重组LN_521和异三聚体一起形成的蛋白质。此术语应解释为涵盖来自天然存在的来源的重组LN_511和异三聚体一起形成的蛋白质。此术语应解释为涵盖来自天然存在的来源的重组LN_121和异三聚体一起形成的蛋白质。此术语应解释为涵盖来自天然存在的来源的重组LN_111和异三聚体够形成紧密的单层，所述单层呈现出色素沉着、吞噬活性、RPE特异性标志物BEST_1、具有分化成RPE细胞的能力和趋势(即，已经被诱导朝向RPE命运)。它们可能共有某些特定尚未获得如上所定义的成熟RPE细胞的所有特征。[0182]缩写hPSC_RPE和hESC_RPE分别代表hPSC衍生的RPE细胞以及hESC衍生的RPE细[0185]本发明部分基于用于鉴别RPE细胞的阳性和阴性标志物的全面细胞表面抗体筛选的hES细胞系的体外分化过程中出现，并且可以预期地从替代细胞类型中鉴别RPE细胞。细胞的大规模生产(实施例2，在图35中示意性地示出)。发明人使用流式细胞术(特别是CD140b和TRA_1_60一起)进行的组合分析表明，在使用本发明的RPE生成方法获得的RPE细超过2000个RPE细胞的单细胞全局转录分析并未鉴别出具有未分化hESC的转录性质的任何NCAM1/CD56可能是与CD140b组合以评估眼区祖代或未成熟RPE存在的良好标层谱系细胞对于RPE应用没有优势，但如此低比例的中胚层谱系在实践中不太可能产生功[0188]CD140b的阳性选择与CD184或GD2的阴性选择组合有效地消除中胚层污染并减少[0189]开发能够实现大规模生产和储存hPSC衍生的RPE细胞的临床合规制造方案依赖于[0190]使用基础培养基并在相关层粘连蛋白上培养的本发明方法非常稳健(实施例2、料最高提升8000倍。考虑到目前用于治疗AMD的细胞替代方法使用100,000_200,000个细胞/眼的剂量，本发明的方案可以在60天内从仅一百万未分化hPSC的初始培养物来生成治[0196]b.将所述干细胞暴露于分化培养基中约15至约50天的第一时间段，以获得包含[0202]优选地，用于第一方面的第一层粘连蛋白和第二层粘连蛋白独立地选自LN_521、胞以约1.2x104个细胞/cm2到约4.8x104个细胞/cm2的细胞密度接种在包括bFGF和/或TGFbeta并进一步包括Rho激酶抑制剂的干细胞培养基中的[0215]根据第一方面的方法中使用的分化培养基可以是不含用于使干细胞维持在多能状态的任何成分的干细胞培养基(即，分化抑制剂)。分化培养基优选有效地不含bFGF和能干细胞自发诱导出RPE细胞。换言之，向分化培养基中添加任何特定因子以诱导或促进[0218]分化培养基的基底组成可以是适用于多能干细胞的培养和维持的任何已知细胞是不含bFGF和TGFbeta的NutristemTMXF培养基([0221]上文所讨论的解离/重新铺板步骤的时机是本发明的重要特征。最佳时机允许解[0222]第一方面的方法可以包括定量表达选自CD140b、CD56、CD104、CD164、CD220或优选地至少40更优选地至少50最优选地至少60％的细胞对上文列表的标志物呈阳[0224]如上所述使用标志物有助于确定解离/重新铺板的最佳时机。除了提供质量控制[0227]第一细胞群体与第一基质的解离可以涉及将基本上整个培养物解离为单一细胞以使细胞与基质解离。可以通过轻轻移液或轻轻摇动细胞培养物容器来机械地辅助解离。地以约1.4×104个细胞/cm2到约1.4×106个细胞/cm2的细胞密度重新铺板在第标志物结合解离来富集第一细胞群体。这可以用于为该方法提供额外的稳健性和/或用作[0235]F2.将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细[0236]细胞的起始混合物可以是在步骤(c)中解离的细胞，并且最终混合物然后在步骤选择用于制备待重新铺板的最终混合物的富[0242]第二群体优选地包括至少70％、更优选地至少80再[0243]第二群体优选地包括不超过30更优选地不超过20再优选地不超过10仍[0244]第二细胞群体优选地包括少于10更优选地少于5再优选地少于3仍更优胞。最优选地，第二群体包括至少95％的RPE细胞、少于3％的非RPE眼区祖细胞以及少于[0250]在本发明的第二方面中，提供了通过根据第一方面的方法获得或可获得的RPE细胞群体。在本发明的另一方面中，提供了通过根据第一方面的方法获得或可获得的RPE细[0251]RPE细胞群体优选地包括至少70％、更优选地至少80再优选地至少90仍更[0252]RPE细胞群体优选地包括不超过30更优选地不超过20再优选地不超过[0253]RPE细胞群体优选地包括少于10更优选地少于5再优选地少于3仍更优非RPE眼区祖细胞以及少于5％的中胚层谱系细胞。甚至更优选地，RPE细胞群体包括至少90％的RPE细胞、少于10％的非RPE眼区祖细胞以及少于5％的中胚层谱系细胞。仍更优选[0255]第二方面的RPE细胞群体优选地用于治疗与年龄相关的黄斑变性。治疗可以包括将来自所述RPE细胞群体的细胞注射到待治疗与年龄相关的黄斑变性的患将所述RPE细胞群体的细胞注射到待治疗斯特格黄斑营养不良(SMD)的患方法包括将通过根据第一方面的方法获得或可获得的RPE细胞群体的细胞注射到待治疗的[0258]注射优选向眼递送约50,000_400,000个RPE细胞(更优选地约100,000个到200,[0262]b.将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细[0264]第三方面的方法可以包括对于富集的最终细胞混合物，选择对CD140b、CD56、[0269]富集的最终细胞混合物优选地包括至少70％、更优选地至少80再优选地至少[0270]富集的最终细胞混合物优选地包括不超过30更优选地不超过20再优选地[0271]富集的最终细胞混合物优选地包括少于10更优选地少于5再优选地少于物包括至少95％的RPE细胞、少于3％的非RPE眼区祖细胞以及少于0.5％的中胚层谱系细[0275]在第四方面中，本发明提供了通过根据第三方面的方法获得或可获得的RPE细胞可以包括将细胞注射到待治疗与年龄相关的黄斑变性或斯特格黄斑营养不良的患者的眼方法包括将通过根据第三方面的方法获得或可获得的RPE细胞混合物注射到待治疗患者的[0277]注射优选向眼递送约50,000_400,000个RPE细胞(更优选地约100,000个到200,分化干细胞(尤其是多能干细胞)的体外细胞培养物的方法，所述方法包括定量表达选自CD140b和CD56的两个或更多个标志物在第五方面的方法中用于定量细胞，组合使用选自[0288]将干细胞暴露于第一细胞培养基中第一时间段，其中第一细胞培养基维持多能[0289]去除第一细胞培养基，并且将干细胞暴露于第二细胞培养基3天到12天的第二时[0290]去除第二细胞培养基，并且将干细胞暴露于含有生长因子为激活素A的第三细胞[0293]第六方面的单一第一层粘连蛋白和单一第二层粘连蛋白可以独立地是层粘连蛋[0294]单一第一层粘连蛋白和单一第二层粘连蛋白可以以约5μg/cm2到约20μg/cm2的浓[0295]第一细胞培养基可以包括以约5μM到约20μM的浓度存在于第一细胞培养基中的mL到约200ng/mL的浓度存在。[0299]优选地，将干细胞以约1.2[0301]在第七方面中，本公开提供了培养干细胞以获得视网膜色素上皮(RPE)细胞的方[0302]分化的细胞通常需要两个因素才能生存和繁殖：(1)为细胞提供结构支撑的基质[0305]第七方面的两种基质均包括单一层粘连蛋白，该单一层粘连蛋白是LN_111、LN_多种细胞培养基组合使用以获得所需的RPE细胞。第七方面的方法中使用了下述的三种不基可以含有Rho相关的蛋白激酶(即Rho激酶或ROCK)抑制剂。ROCK抑制剂可以以约5μM到约mL。例如，第一细胞培养基可以是含有bFGF和TGFβ的NutristemTMXF培养基(Biological养基的示例是不含bFGF或TGFβ(且未补充有ROCK抑制剂)的Nu约200ng/mL的浓度存在。适当第三细胞培养基的示例是其中添加了激活素A的NutristemTM以将干细胞以约1.2x104个细胞/cm2到4.8x104个细[0310]然后将干细胞暴露于第一细胞培养基中约12小时到约48小时，包括约24小时(即养基)对来自第一细胞培养基质的单层进行胰蛋白酶化，然后形成可用于接种第二细胞培[0314]然后将干细胞暴露于第二基质上的第二细胞培养基(即无ROCK抑制剂或生长因[0315]优选地，分化方案可以使得从分化开始到所得RPE细胞成熟的总时间为约九(9)[0316]本公开的第七方面的方法提供了单层中RPE细胞的确定的且不含异种物质的分化质量控制目的等)。本文还描述了视网膜色素上皮细胞纯度的释放和质量控制标准。天然鉴别为RPE细胞的阳性或阴性选择标志物。阳性选择标志物包括CD140b、CD104、CD164、[0324]去除所述第一细胞培养基，并且将所述干细胞暴露于第二细胞培养基第二时间[0328]2.第1项所述的方法，其[0329]3.第1项所述的方法，[0330]4.第1项所述的方法，其中所述第[0333]7.第6项所述的方法，其中所[0340]14.第1项所述的方法，其中所述第二时间段是约72小时(3天)至约288小时(12[0343]17.第1项所述的方法，其中将所述诱导的RPE细胞以约1.4x106个细胞/cm2至约[0347]将对所述细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述细胞表面标志物呈阴性的细胞[0349]21.第19项所述的方法，其中所述细胞表面标志物是GD2、CD184、CD10、CD30、[0352]将对所述第一细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第一细胞表面标志物呈阴[0354]用靶向RPE细胞上的第二细胞表面标志物的抗体来标记细胞的所述第一混合物；[0355]将对所述第二细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第二细胞表面标志物呈阴[0357]用靶向RPE细胞上的第三细胞表面标志物的抗体来标记细胞的所述第二混合物；[0358]将对所述第三细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第三细胞表面标志物呈阴[0359]25.第22_24项中的任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物是CD140b、[0361]用靶向非RPE细胞上的第一细胞表面标志物的抗体来标记细胞的起始混合物；以及[0362]将对所述第一细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第一细胞表面标志物呈阴[0364]用靶向非RPE细胞上的第二细胞表面标志物的抗体来标记细胞的所述第一混合[0365]将对所述第二细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第二细胞表面标志物呈阴[0367]用靶向非RPE细胞上的第三细胞表面标志物的抗体来标记细胞的所述第二混合[0368]将对所述第三细胞表面标志物呈阳性的细胞与对所述第三细胞表面标志物呈阴[0369]29.第26_28项中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物是GD2、CD184、胞术使用识别242种CD抗原的抗体库(BDBiosciences560747)将细胞表面标志物的表达[0382]筛选鉴别了在两种细胞类型中表达且对OV或hESC具备特异性的细胞表面标志物养物，我们先前显示所述培养物在Plaza_Reyes等人(同上)中所述的先前研究中是高纯度结出最有希望的结果，CD140b被鉴别为早期以及更成熟hESC_RPE细胞的标志物，而GD2和[0400]与该发现一致，证明CD140b在剩余非着色的EB结构上更局而在非着色结构中检测到较高水平的GD2和CD184(图26)。此外，成熟hESC衍生的RPE细胞的hESC_RPE细胞中免疫荧光染色所证实(图5)。移植到白化兔视网膜下的hESC_RPE的组织有效视网膜命运诱导剂的先前研究相一致，观测到色素沉着的显著增加以及添加激活素A[0404]使用源自实施例1的新标志物进行的流式细胞术分析支持该结果，其在两种基质[0405]接下来，将单层分化与先前建立的如Plaza_Reyes等人(同上)研究中所制备的EB[0406]LN_111或LN_521上的单层培养有效地支持了从未分化多能态对RPE命运的初始诱养物确实如上所述生成了一些着色结构，但在分化的7周结束时，单层中以着色细胞为主胞[0411]由于层粘连蛋白单层培养物对于在第4和7周时>80％细胞呈CD140b阳性的hESC_RPE分化而言是允许的，因此探讨了通过引入重新铺板策略能否获得纯度更高的hESC_RPE[0414]进行了滴定实验，其中解离的细胞以从1:1到1:100的递增稀释度重新铺板。CD140b阳性hESC_RPE细胞的最终产量随稀释度增加相对于起始多能干细胞的数目达到最[0416]在临床前大眼动物模型中，确认了已重新铺板hESC_RPE的成功视网膜整合(参见矢状面成像显示着色细胞和具有最初源自hrLN_521和hrLN_111的hESC_RPE的保守视网膜[0418]尽管实施例2中证明的方法确实产生了似乎是纯的hESC_RPE细胞，但是仍然存在[0419]为此目的，对于如上文实施例2中所述重新铺板的培养物，或另外地在第30天用CD140b作为正向选择以及使用GD2或CD184作为负向选择的组合进行纯化的培养物进行了析。单细胞分析表明，来自重新铺板或分选后群体的细胞均未表达多能性转录物POU5F1、有较高CD56强度的小聚簇，这也与和成熟程度低的细胞一致的低色素沉着水平相一致(图29)。与测序数据一致，与分选的培养物相比，在重新铺板的培养物中检测到更大的CD56的细胞系已达到接近100％的CD140b水平，现在将祖代标志物NCAM1/CD56降低至低于10%在实施例1中鉴别的标志物在生产过程中作为质量对照物的用途，以消除批次间差异或消[0427]使用TrypLETM将hESC和hESC_RPE细胞解离为单个细胞5_10分钟。使用TrypLETM将μM)标记20分钟。然后使用BDLyoplateTM筛选板(BDBiosciences)按照制造商的方案对这(BDBiosciences)或配备405nm、638nm、488nm和561nm激光的CytoFLEXSTM(BeckmanCoulter)细胞分析仪的96孔板上分析样品。使用7_AAD核酸染料(BDBiosciences)将非存并且适于在hrLN_521上无饲养层培养。通过在5％CO2/5％O2培养箱中的NutriStemTMhPSCXF培养基(BiologicalIndustries)中在包被有hrLN_521的板(BioLaminaAB)上进胞铺板在新鲜的包被有hrLN_521的培养皿上。传代后两天，将此培养基用新鲜预热的[0432]使用NutriStemTMhPSCXF培养基将hESC以2.4x104个细胞/cm2的细胞密度铺板在添加浓度为10μM的Rho激酶抑制剂(Y_27632，Millipore)，同时将细胞保持在37℃、5%O2下(R&DSystems)添加到培养基中。每周进行细胞饲养3次，并保持30天。然后使用TrypLETMbFGF和TGFβ的NutriStemTMhPSCXF培养基每周3次对重新铺板的细胞进行饲养。有关3D悬III逆转录酶(GIBCOInvitrogen))中合成cDPOU5F1(cat.no.Hs03005111_g1)、BEST1(cat.no.Hs00188249_m1)、RPE65TBB3(cat.no.Hs00801390_s1)的TaqmanTM探针以鉴别和门控阴性和阳性细胞。使用配备488nm、561nm、405nm和640nm激光(BeckmanCoulter)的CytoFLEXTM流式细胞仪分析染色的细胞。使[0440]用免疫荧光评估成熟hESC_RPE单层的蛋白质表达。细胞在室温下用4％不含甲醇的甲醛固定10分钟，然后在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中用0.3％TritoFBS、0.1％Tween_20TM、DPBS溶液中稀释至指定浓度：NANOG(1:200，ReproCellTMFBS、0.1％Tween_20、DPBS溶液中以1:1000稀释的AlexaFluor647驴抗兔IgG和Alexa在固定溶液(FS)中固定24_48小时之前，进行玻璃体内注射由4％缓冲甲醛(SolvencoAB)的牛血清白蛋白(JacksonImmunoresearch)的TBS中稀释的10％正常驴血清(Abcam)封闭封闭缓冲液中以1:200稀释的二抗(AlexaFluor555驴抗兔IgGA31572和AlexaFluor用带有DAPI封固介质(VectorLaboratories)的载体vectashield封固在24x50mm盖玻片SantaCruzBiotechnologysc_432)和CD56/NCAM1(1:100，SantaCruzBiotechnology[0445]用OlympusIX81TM荧光倒置显微镜拍摄图像。使用ImageJTM软件对图片进行采集[0447]FITC标记的牛光感受器外节(POS)由巴黎视觉研究所(InstitutdelaVision)上培养1个月。将细胞分别与稀释于DMEM或CO2非依赖性培养基(均来自ThermoFisher[0448]用ZeissLSM710_NLOTM点扫描共聚焦显微镜采集图像。使用培养基后60小时，从hESC_RPE顶端侧和基底侧(分别表示transwell的上部和下部隔室)收VEGF和PEDF分泌水平。使用SpectraMaxTM250酶标仪(Mol[0452]根据制造商的说明，使用MillicellTM电阻系统伏特欧姆计(MillicellERS_2，Millipore)测量铺板在TranswellsTM(0.33cm2，Millipore)上的RPE细胞的跨上皮电阻变的培养基中一式三份在每个孔的三个不同位置进行测量。使用平均值进行进一步分析。[0454]使用TrypLETMSelect解离60天的hESC_RPE细胞，并使其通过细胞过滤器(4℃下运输到真核单细胞基因组学实验室(EukaryoticSingleCellGenomicsFacility，[0455]使用CellRangerTM2.1.1(10XGenomSeuratTM套件版本2.3.4在R版本3.5.1(RCoreTeam)中分析CellRangerTM质量[0456]通过两种方法分析细胞聚簇。首先使用WilcoxonRankSum检验为每个聚簇鉴别(模块评分)。使用SeuratTM的交互式绘图功能将表达中胚层标志物的细胞手动细分为单独[0458]经过北部斯德哥尔摩动物实验伦理委员会(NorthernStockholmAnimal研究中使用动物说明(StatementfortheUseofAnimalsinOphthalmicandVision使用0.4％台盼蓝(ThermoFisherScientificCorp.)的Neubauer血细胞计数器中进行计苯噻嗪(RompunTMvet.20mg/ml，BayerAnimalHealth)对动物进行全身麻醉，然后用0.75％环戊酸酯/2.5％苯肾上腺素(APL)的混合物进行瞳孔散大。如前所述(Petrus_吸入连接到延伸管和38G多尖端插管(MedOneSurgicalInc)的1mL注射器中。无需事先进手术前一周施用2mg(100μL)的玻璃体内曲安西龙(triamcinolone)(TriescenceTM，Alcon