CN119410708A 星状病毒复制子的方法和组合物 （高级健康研究所）

202080041231.02020.06.10本发明提供了重组复制子和所述重组复制子用于表达所分泌的所关注蛋白质以便诱导增2b.第二开放阅读框，所述第二开放阅读框包括对第一星状病毒非结c.第三开放阅读框，所述第三开放阅读框包括对2.根据权利要求1所述的重组复制子核酸，其中所述第一开放阅读框进一步包括对星星状病毒保守序列元件在所述第一开放阅读框内开始并且延伸超过所述第一开放阅读框8.根据权利要求7所述的重组复制子核酸，其中所述第一星状病毒基因型是HAstV9.根据权利要求1所述的重组复制子核酸，其中所述第三开放阅读框包含翻译上游核11.根据前述权利要求中任一项所述的重组复制子核酸，其中所述第一开放阅读框进一步包括对具有核糖体跳跃特性的肽进行编码的核酸12.根据权利要求11所述的重组复制子核酸，其中所述具有核糖体跳跃特性的肽是来14.根据权利要求13所述的纳米颗粒，其基本上由含有所述重组复制子核酸的纳米结15.一种调配物，其包括在药学上可接受的载体中的多个根据权利要求13或14中任一18.一种治疗受试者以使所述受试者产生免疫力的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求16所述的调配物并且由此引发所述受试320.一种从细胞分泌所关注蛋白质的方法，所述方法包括将根据21.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括从所述细胞培养物采集所述所关注蛋23.一种向受试者递送所关注治疗性蛋白质的方法，所述方法包括向所述受试者施用24.一种向受试者递送治疗量的所关注蛋白质的方法，所述方法包括向受试者施用有4[0002]本发明涉及用于引发改进的免疫应答的重组复制子和使用所述重组复制子的方[0003]使用疫苗产生免疫力的一个基本方面是将向受试者递送免疫原性剂以便引发来[0004]当前的复制子技术最初是基于将RNA复制子包装在具有或不具有包膜糖蛋白的源自病毒的核衣壳(被称为病毒复制子颗粒(VRP)[0005]利用可以防止RNA降解的各种调配物的RNA非病毒递送的出现使得利用含有感染稳健的抗原表达动力学归因于所述复制子使用了对所关注异源基因进行编码的亚基因组以及对宿主的IFN介导的抗病毒状态的稳健诱导和对宿主的IFN介导的抗病毒状态的抗性。现出与现有平台相同或相似的有益特性的较小基因组的复制子仍然是合乎[0006]本公开通过提供符合这个期望的特征并且有效诱导增加的免疫应答的重组星状放阅读框，所述第一开放阅读框包括a.)对可以由细胞分泌的所关注蛋白质进行编码的亚5读框包括对第二星状病毒非结构蛋白(nsP1b)进行编码且包含亚基因组启动子的核酸序星状病毒保守序列元件在所述第一开放阅读框内开始并且延伸超过所述第一开放阅读框所述所关注蛋白质并且由此向所述受试者递送治疗量的所述所关所关注治疗性蛋白质的方法包括向所述受试者施用所述6[0018]图1A_C示出了人类星状病毒基因组的组构和所述组构对于表达所关注蛋白质的和ORF2的基因组组构的示意图，并且还示出了被提出在亚基因组转录和翻译中发挥作用2的侧翼序列和邻近ORF2的3'非翻译区(3'UTR)的四个修饰组合之一。图1C示出了由图1B中所描述的复制子在用100ng复制子以及分别作为阳性对照和阴性对照的对nLUC或寨卡病毒(ZIKV)抗原进行编码的α病毒复制子转染并在24小时后采集的293T细胞中对nLUC进行的[0019]图2A_G示出了在诱导肌内注射的C57Bl/6小鼠的免疫应答的能力方面在纳米结构脂质调配的复制子之间进行的比较。图2A示出了以对所关注基因(GOI)进行编码的亚基因个剂量的NLC调配的复制子)以及裸复制子对照和模拟注射对照进行的蚀斑减少中和测试显示了来自单独的ID_93蛋白的结果以及在具有GLA_SE佐剂的情况下的结果。图2G示出了在给予未经处理的小鼠和先前用对血凝素基因的部分序列进行编码的星状病毒复制子致敏的小鼠单剂量的无佐剂的线性表位(PR8血凝素(HA)亚基)后的抗血凝素免疫球蛋白G3A示出了涵盖野生型(WT)HAstV的ORF1b的3'端和5'端ORF2的400个核苷酸(nt)区的预测发夹结构的明显丢失。图3C示出了包含ORF2的前30个nt(在结构的右下方以轻量线描绘)个nt的复制子中的来自图1B的三个复制子和具有以下的包含ORF2的前30个nt的三个复制饰的5'侧翼序列(Δ5'_30nt_3')；和添加了明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)核糖体跳跃序列的未[0021]图4A_C示出了用于检测α病毒复制子和星状病毒复制子中的亚基因组转录和翻译的偶联转录和翻译测定的结果。图4A示出了感染野生型HAstV的CaCo_2细胞中的亚基因组细胞后的定量逆转录聚合酶链反应(qRT_PCR)和荧光素酶测定结果。图4C示出了用对nLUC进行编码的α病毒复制子以及未封端的对照转染293T细胞后的qRT_PCR和荧光素酶测定结7[0022]图5示出了在5'_30nt_T2A_3'复制子之间进行的在两种类型细胞中的基因表达的中所描述的每种质粒转染后24小时对BHK细胞裂解物进行的双重荧光相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术40Kb之间、介于5Kb与40Kb之间、介于5Kb与30Kb之间、介于5Kb与20Kb之间或介于10Kb与在多于一个开放阅读框，并且一个开放阅读框可以与同一分子上的另一个开放阅读框重框ORF1a的起始AUG的上游的核酸[0029]“星状病毒3'非翻译区(3'UTR)”意指星状病毒基因组的包括定位于开放阅读框8[0034]一些实施例提供了包括包封在超分子结构中以形成纳米颗粒的复制子的组合物在纳米结构脂质载体(NLC)中的复制子。Erasmus等人,《分子治疗学(Molecular然地选择来使活性成分的任何降解减到最少并且使受试者中的任何不良副作用降到最低疫苗或其它免疫原性组合物等药物调配物可以包括免疫原性量的所公开的星状病毒复制[0038]星状病毒复制子通过将所述星状病毒复制子的较小的基因组大小与由α病毒复制子所提供的那些特征组合提供了一种有吸引力的替代方案：亚基因组RNA复制策略和有所的有效量可以由本领域技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确9[0040]本文所描述的复制子RNA组合物以与剂量调配物相容的方式并且以预防和/或治效量可能取决于医师、兽医或其它健康从业者的判断并且可能对给定的受试者具有特异疗应答的另一个实例是通过刺激受试者的免疫系统来增加对病原性疾[0049]将各种星状病毒复制子序列合成并克隆到在T7启动子下游和肝炎δ病毒核酶序[0051]野生型(WT)人类星状病毒(HAstV)复制机制由5'和3'非翻译区(UTR)以及分别由[0052]开发了含有这些保守序列元件的组合的四个复制子以测试所述四个复制子对ORF照和阴性对照的对nLUC或寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)抗原进行编码的α病毒复制子转染[0055]接下来，对5'_3'HAstV复制子诱导T细胞对结核分枝杆菌抗原ID_93或寨卡病毒白进行编码的序列，并使用Gibson组装将所述序列克隆到在AvrII限制位点与PvuI限制位点之间的5'_3'HAstV复制子(图2E)和在PflMI限制位点与SacII限制位点之间的源自委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequineencephalitisv质载体中，并通过单次肌内注射向C57BL/6小鼠体内施用1μg每个复制子。对于ID_93复制复制子与更传统的疫苗制备之间进行T细胞应答比较，所述更传统的疫苗制备先前已经示非病毒递送在单次肌内注射后驱动了对经过编码的抗原的有效CD8+和抗体应答(图2B_D)，但是对相同抗原进行编码的源自星状病毒的复制子驱动了显著更高的抗原特异性CD4+T细[0057]为了测试对线性表位的这些CD4+T细胞应答是否可以增强对整个蛋白亚基的抗体应答，将C57Bl/6小鼠用单剂量的对血凝素(HA)基因的15个氨基酸(aa)序列进行编码的星状病毒复制子致敏，所述HA基因在季节性流感病毒亚型之中是保守的并且先前示出在[0060]对预测二级RNA结构的WTHAstV中的包含所提出的亚基因组RNA启动子的400_bp夹结构(表示为用轻量线和中量线呈现的结构)只有在WT序列与复制子序列之间保守的发夹(以轻量线描绘的)。通过将来自ORF2的另外的21个nt(以轻量线在图的右下方描绘的)包含在内，三发夹结构似乎在预测中变得稳定[0061]为了评估这30个nt在HAstV复制中的作用，构建了含有具有或没有ORF1b义突变的30_nt序列的另外的HAstV复制子(分别为5'_30nt_3'复制子或Δ5'_30nt_3'复制脉扁刺蛾病毒2A(T2A)核糖体跳跃序列以制备5'_30nt_T2A_3构建体包含分别作为阳性对照和阴性对照的两个委内瑞因的一个委内瑞拉马脑炎病毒复制子(VEE_nLUC)和包含ZIKV抗原基因的另一个委内瑞拉马脑炎病毒复制子(VEE_ZIKV))。在转染后24小时，进行荧光素酶测定以定量异源基因表[0064]已经证明了前30个nt在ORF2表达中的重要性，接下来对这个序列元件在亚基因[0065]定量逆转录(qRT)PCR测定旨在定量在星状病毒复制期间累积的基因组和亚基因RNA，并在qRT_PCR测定中与要用作标准曲线的来自同一病毒的感染性克隆的T7转录的RNA4A)，重新概括先前公布的RNA印迹(northernblot)数据并确认这个测定确实可以检测到设计了一种类似的qRT_PCR测定来检测α病毒复制子的基因组和亚基因组。虽然α病毒复制利用允许ORF2独立于亚基因组RNA转录进行早期翻译的替代性的ORF2表达机制。已经对[0069]检查了与基因组转录和亚基因组转录的差异相关的ORF1a区，其被称为高变区公布的对CaCo_2细胞上的wt病毒观察到的数据。细胞系之间结果的差异表明了HVR在宿主毒类似的方式利用允许在复制周期早期进行ORF2的亚基因组转录_独立翻译的ORF1b与中产生了对由HAstV_1的ORF1b和ORF2的808bp区隔开的海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶及ORF2起始密码子的重要性，因为杯状病毒中的TTR已经示出取决于上游ORF终止密码子照(3'终止)将下游ORF(萤火虫)表达相对于上游ORF(海肾)表终止密码子来改变位置从而导致ORF1b阅读框在终止前延伸另外的34个密码子似乎消除[0074]杯状病毒中的TTR的机制已经示出取决于宿主18s核糖体RNA中的互补序列与杯状病毒基因组中的上游序列(被称为翻译上游核糖