CN119410712A 一种实现脊尾白虾或凡纳滨对虾子代靶基因编辑的方法 （中国科学院海洋研究所）

号一种实现脊尾白虾或凡纳滨对虾子代靶基本发明涉及一种实现脊尾白虾或凡纳滨对将Cas9RNP(sgRNA和Cas9核糖核蛋白混合形成的混合物)注射到卵巢正在发育的脊尾白虾或凡纳滨对虾体内。使用的sgRNA是基于脊尾白虾或法还可用于向脊尾白虾或凡纳滨对虾等十足目2Cas9RNP为Cas9蛋白与引导RNA的混合物；所述引导RNA为脊尾雄性性别分化控制基因EcIAG或凡纳滨对虾雄性性别分化控制基因脊尾白虾雄性性别分化控制基因EcIAG的引导RNA为EcIAG_gRNA1和/或EcIAG_gRNA2，其中EcIAG_gRNA1的核糖核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示，EcIAG_gRNA2的核糖核核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示，LvIAG_gRNA2的核糖核苷酸序列如序列表中SEQ6.根据权利要求1所述的子代靶基因编辑的方法，其特征在于，所述混合物中Cas9蛋9.根据权利要求1或8所述的子代靶基因编辑的方法，巢处于II期或III期发育时期的脊尾白虾或凡纳滨对虾的卵细胞递送其他生物大分子物具有相似卵巢发育过程的十足目甲壳动物的3识别作用建立了一种受体介导的货物卵巢转运系统方法(ReMOT)，该方法将可被卵黄蛋白原受体识别的多肽序列P2C与Cas9重组表达，将重组蛋白与gRNA混合后直接注射到雌性成体中，实现了卵子的靶基因编辑，该方法建立了不依赖显微注射的疟蚊基因编辑技术(Chaverra_Rodriguez,D.,Macias,V.M.,Hughes,G.L.etal.TargeteddeliveryofCRISPR_Cas9ribonucleoproteinintoarthropodovariesforheritablegermlinegeneediting.NatCommun,2018,9:3008.Doi:10.1038/s41467_018_将Cas9RNP(sgRNA和Cas9核糖核蛋白混合形成的混合物)注射到卵巢发育过程的脊尾白[0004]本发明专利的目的为提供一种通过脊尾白虾或凡纳滨对虾母体肌肉注射Cas9RNP实现子代基因编辑的方法，通过肌肉注射的方式直接将Cas9RNP注射到卵巢正在发育4性性别分化控制基因EcIAG的引导RNA，或者为凡纳滨对虾雄性性别分化控制基因LvIAG的[0006]进一步地，所述靶基因为脊尾白虾雄性性别分化控制基因EcIAG或凡纳滨对虾雄[0010]脊尾白虾雄性性别分化控制基因EcIAG的核苷酸序列如列表中SEQ脊尾白虾雄性性别分化控制基因EcIAG的引导RNA为EcIAG_gRNA1和EcIAG_gRNA2，其中EcIAG_gRNA1的核糖核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示，EcIAG_gRNA2的核糖核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示，当引导RNA为EcIAG_gRNA1和EcIAG_gRNA2时，EcIAG_[0011]凡纳滨对虾雄性性别分化控制基因LvIAG的核苷酸序列如列表中SEQIDNo.4所[0012]该方法还可应用于向处于该卵巢发育时期的脊尾白虾或凡纳滨对虾的卵细胞递2、脊尾白虾已有的基因编辑技术是基于显微注射方法实现编辑体系向受精卵的5性别分化控制基因EcIAG及引导RNA与应用)ATGTCAACCTGTAATATCGGAGTCAAGAAGGTGTTCTTTTGTGTTTTGTTGGCGTTATGCTTGATGCAGCCTTCTTCCGGCTACACCATTGAATGTCTTTCTGTTGACTTTGATTGTGGCGATATTCCGCAAACCCTTGCATCAGTTTGCAGGGTATACAAACCATTCGTCCCCTTCAATCAACCCTTCATTACCAAAAGGCGGCGTTCTGTGAGCAACTCCACCCAACTTCCAATTGAGTGTTCCTCGCCCTTCTTCCACCCACGAGCCACCCACCTGACGAAGGCAAAGGCTGACGAAGGCAGTGTCATGGCGTTGGAGATGCCAAGTGAGATTCGAGACATGTTTATAAGTCAGGAGAAAGCAAACATGATGCTTCAGTCGAATCGCAGACTCCGACGGCATGGGCAAAGAAATACGCCGAGGGATGAATGTTGTGCCGTCAAAGATTGCTGCACCTTTGAGGAAGTCGCCGAATATTGTGTTGAAGTGCGTCCCGGAGCCCTAACCTGCGAAAGACCACAGGACGGTTCCTCGCCTATGGTCCCCAATTGCACACCTGCCGTTCCGGAGATAATACGACTCACTATAGTCAACAGAAAGACATTCAAGTTTTAGAGCTAG6TAATACGACTCACTATAGGTTGATTGAAGGGGACGAAGTTTTAGAGCTAG[0024]使用的凡纳滨对虾靶基因是雄性性别分化控制基因LvIAG(NCBIAccessionNo.ATGAACCAACTCGCTGCCTCACGCACTCACGGCCTCGACGTGCCTGCTCAACTGTTACTCGGATTGCTGATGCTTCTCTCGCTGACTTCGACGTCGATCGGCTACAACGTCACAGGGATTCCTGTGGACTTCGACTGCGGTGACATCGGCGACACCATGAGCCAGATCTGCAAGACGTTCCCCACGGCCAGGCCCCACGTGAGAGTGTCAAGGTCAGCCGATACCGACGACCTCTGGCAGGACGCGGGGGCAGGTCAGACAACGCCCCCTGACCTGCTCCCCCGCCGGCACCGCCTCCACCCCAGGGCCCTGAATCCAACGTGGAATCTCGAAAGGGACCTGATCAGAGACATCCTAGTGAGCCCCGAAGCCGCGCACGCCCTCGTCAGGACGCCCCGGGGCCGCGCGAAGAGGTCCTACAACGTGCAGGACGAGTGCTGCAACCACGTGAGCCAGCGGATGTGTGTGGCGGAGGAGATCCTGGAGTATTGCGAGGACCCGTACTAATACGACTCACTATAGGCGATACCGACGACCTCTGGCGTTTTAGAGCTAG7TAATACGACTCACTATAGGACGTTGGATTCAGGGCCCTGGTTTTAGAGCTAG将pET_28b_Cas9_His质粒转化至感受态细胞Transetta(TransGenBiotech)中，a)取50μL冰浴上融化的Transetta(DE3)感受态细胞，加入3μL提取的pET_28b_c)向离心管中加入500μL的无抗性LB液体培养基，混匀后置于37℃,200d)取60μL已转化的Transetta(DE3)感受态细胞加到含有质量浓度0.1％的卡那霉e)挑取单克隆：用灭菌牙签挑取单菌落至含有卡那霉素的500μLLB液体培养基，f)取50μL菌种液接种至含有卡那霉素的5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养过g)取200μL的菌种液至含有卡那霉素的200mLLB液体培养基中，37℃震荡培养至b)4℃下12000rpm离心15min，小心的将上清液(已澄清的样品性别分化控制基因EcIAG及引导RNA与应用，专利号CN116622717A)和凡纳滨对虾雄性性别8GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGA然后将框架序列连入pMD19_T载体(TaKaRa,D102A)的TA克隆位点，获得gRNA框架[0030](2)gRNA模板的合成使用在线工具CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)选LvIAG_gRNA1_F:TAATACGACTCACTATAGGCGATACCGACGACCTCTGGCGTTTTAGAGCTAGAALvIAG_gRNA2_F:TAATACGACTCACTATAGGACGTTGGATTCAGGGCCCTGGTTTTAGAGCTAGAA使用T7体外转录试剂盒TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKitATP/TTP/CTP/UTPmix(核苷TranscriptAidEnzym9测。使用酚/氯仿抽提法(LeeS.Toni,etal.,Optimizationofphenol_chloroformRNAextraction,MethodsX,2018,5:599_608)从消化后的体系获取gRNALvIAG_gRNA1体肌肉注射实验过程见（5受精之后待受精卵发育至囊胚期时(此为受精后第5天)收集利用裂解液微萃取的方法(Gaoetal.,CRISPR/Cas9_mediatedmutationonaninsulin_likepeptideencodinggeneaffectsthegrowthoftheridgetailwhiteprawnExopalaemoncarinicauda,FrontEndocrinol,2022,13:986491.)对随机挑选的胚胎的基因组DNA进行提取，对EcIAG的两个sgRNA的CRISPR靶点侧翼的基因组区2xReactionMix(反应液)12.5GoldenDNApolymerase0.2510.50.5145700bp左右的单克隆菌液到送北京睿博利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用1002834.8%3729.2%4730.4%500600112003004430.7%此次选取处于卵巢发育II期的10尾雌性脊尾白虾进行注射，Cas9RNP的配制同162.5%2003833.3%4650060071800900[0044]从以上结果中可以看出基于脊尾白虾成体注射RNP方法是可行的，能够通过成体雌性凡纳滨对虾的选取和注射方法与脊尾白虾相同，共选择4尾雌性凡纳滨对虾第一轮PCR扩增所用引物为包含接头和靶基因正向引物序列为Lv_IAG_barcode_F:ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCCACAAAAC反向引物序列为Lv_IAG_barcode_R:TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCAATTA50.50.54MultiplexDNAPolywerase(high0.25。第二轮PCR扩增将正向标签(barcode)和反向标签(index)添加到每条序列上，第正向引物序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAACGTGATACACTCTTTCCCTACAGAGATTAGCTTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG（SEQIDNo.16以第一轮产物为模板