综合化学实验配位化学和生物无机化学部分

综合化学试验——配位化学和生物无机化学部分切割DNA金属配合物指导教师：毛宗万

黄华珍cesmzw@huanghuazhen@中山大学化学与化学工程学院年10月/ChemEdu/Echemi/comlab/index.htm第1页试验3功效型甘氨酸铜配合物合成和表征模板合成IR光谱表征自由基UV光谱检测试验4功效型甘氨酸铜配合物对质粒DNA切割琼脂糖凝胶电泳凝胶成像总课时：15课时地点：丰盛堂218室试验内容第2页Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ线型DNA自由基机理自由基进攻糖环或碱基，造成氧化破坏酯水解机理亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应酯水解机理优于自由基机理DNA结构及其断裂方式第3页配合物与未受损DNA表面结合并诱导其断裂深入在新断裂处结合断裂反应互补链断裂DNA自由基断裂第4页试验背景——模拟博莱霉素在天然物质中，由5个氨基酸、2个六碳糖和1个氨基侧链组成博来霉素（bleomycin）可造成DNA链断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药品。第5页造成DNA链断裂原因是因为博来霉素分子一部分是铁或铜配合物，这类配合物能够产生造成DNA链断裂自由基。CuP-3A配位结构示意图博莱霉素活性中心第6页Pamatong,F.V.;Detmer.C.A.,III;Bocarsly,J.R.;J.Am.Chem.Soc.,1996,118,5339.Detmer.C.A.,III;Pamatong,F.V.;Bocarsly,J.R.;Inorg.Chem.,1996,21,6292.博莱霉素模型化合物Cu2++e-=Cu+

Cu++H2O2=Cu2++OH-+

OH第7页氨基酸铜化合物合成路线第8页模板反应化学机理第9页化合物1红外光谱

(COO-)

(COO-)

(NO2)

(NO2)第10页化合物2红外光谱

(COO-)

(COO-)

(NH2)第11页氢氧自由基形成和UV光谱检测因为罗丹明B可与HO·快速反应，并在553nm有强吸收，所以我们能够利用此反应采取分光光度法检验HO·生成。

第12页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一个非常简便、快速、最惯用分离纯化和判定核酸方法琼脂糖是从海藻中提取一个线状高聚物依据琼溶解温度，把琼脂糖分为普通琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段回收，质粒与外源性DNA快速连接等第13页第14页凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2第15页电泳缓冲液惯用三种缓冲液

Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE)TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，轻易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较廉价，因而推荐选取TAE。缓冲液中EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶活性，预防PCR扩增产物降解第16页核酸电泳指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰迁移率与双链线性DNA片段二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb第17页核酸电泳染色剂——溴化乙锭一个荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/mlEB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量普通>5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察ethidiumbromide，EB第18页电泳试验装置电泳仪（普通）电泳槽（水平平板）灌胶模具等第19页电泳试验方法洗净电泳槽，架好梳子配制琼脂糖凝胶及倒胶上样与通电结果观察第20页配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）第21页上样与通电在DNA样品中加入0.2体积载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内接通电源，普通红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间距离计算）依据指示剂泳动位置，判断是否终止电泳。普通电泳条件为：电压90V，时间40min。第22页结果观察和统计紫外仪上观察电泳带及其位置拍照深入使用软件对光密度进行分析第23页DNA断裂凝胶电泳图Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ线型DNA第24页合成试验关键点检验回流装置是否保持干燥硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解溶液合成试验中前半个小时注意观察反应混合物颜色改变，亮蓝色或紫蓝色为反应正常试验中化合物合成与DNA断裂试验需交叉进行，DNA断裂所需配合物由准备室提供若硝基还原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多出溶剂凝胶电泳摄影需戴手套第25页模板合成——大环化合物合成方法（218室）旋转蒸发器——除去多出溶剂（218室）红外光谱——化合物结构表征（201室）紫外可见光谱——跟踪罗丹明B与氢氧自由基反应（204室）凝胶电泳——切割DNA（210室）凝胶成像分析——检测DNA断裂情况（210室）试验技术和方法第26页试验要求写好预习汇报（查阅药品及溶剂性质、羧基和硝基IR特征峰值、光谱技术