2025 鸭病毒性肠炎诊断技术

GB/T22332—2025

目次

前言

…………………………Ⅲ

引言

…………………………Ⅳ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

缩略语

4……………………1

临床诊断

5…………………2

样品采集保存与处理

6、……………………3

病毒分离鉴定

7……………3

中和试验固定病毒稀释血清法

8(-)………………………5

直接免疫荧光

9……………6

间接

10ELISA……………7

11PCR……………………9

疫苗株与野毒株鉴别

12PCR……………11

荧光定量

13PCR…………………………12

综合判定

14………………13

附录规范性溶液配制

A()………………14

附录资料性原代细胞制备方法

B()……………………16

附录资料性组织培养半数感染量测定方法法

C()(TCID50)(Reed-Muench)………17

附录资料性中和试验加样示意图

D()…………………18

附录资料性及荧光定量结果图

E()PCRPCR………19

Ⅰ

GB/T22332—2025

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件代替鸭病毒性肠炎诊断技术与相比除结构调

GB/T22332—2008《》,GB/T22332—2008,

整和编辑性改动外主要技术变化如下

,:

增加了缩略语见第章

———(4);

更改了临床诊断的相关要求见第章年版的第章

———(5,20082);

更改了样品采集保存与处理的相关要求见第章年版的第章

———、(6,20083);

更改了病毒分离鉴定的相关要求见第章年版的第章

———(7,20083);

增加了中和试验见第章

———(8);

增加了直接免疫荧光法见第章

———(9);

增加了间接方法见第章

———ELISA(10);

更改了方法的相关要求见第章年版的第章

———PCR(11,20084);

增加了疫苗株与野毒株鉴别方法见第章

———PCR(12);

增加了荧光定量方法包含疫苗株与野毒株鉴别诊断方法见第章

———PCR()(13);

增加了诊断结果的综合判定见第章

———(14)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出

。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会归口

(SAC/TC181)。

本文件起草单位中国动物卫生与流行病学中心浙江省农业科学院山东省农业科学院家禽研究

:、、

所华南农业大学山东中新食品集团有限公司

、、。

本文件主要起草人蒋文明刘朔陈柳张存李玉峰云涛崔雪志王静静叶伟成于晓慧李阳

:、、、、、、、、、、、

郭宵峰刘华雷

、。

本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为

:

年首次发布为

———2008GB/T22332—2008;

本次为第一次修订

———。

Ⅲ

GB/T22332—2025

引言

鸭病毒性肠炎又称鸭瘟是由疱疹病毒科甲型疱疹病

(Duckvirusenteritis,DVE),(Duckplague),

毒亚科马立克病毒属鸭疱疹病毒型引起的鸭鹅和天鹅雁形目的一种急性热性接触性传染病

1、()、、。

病原鸭疱疹病毒型又称鸭肠炎病毒鸭瘟病毒

1(Duckenteritisvirus,DEV)、(Duckplaguevirus,DPV)

和病毒本病以高热血管损伤致使组织体腔出血消化道黏膜的疹性损害淋巴器官

DVE(DVEV)。,、,,

病变和实质器官退行性变化为特征本病传播迅速发病率和病死率都很高严重威胁养鸭业的发

。,,

展对野生水禽存在潜在威胁尚未见其他禽类哺乳动物或人类感染的报道病原只有一个血清

,。、。

型不同毒株在致病性上存在差异目前主要依靠弱毒活疫苗进行防控

,。,。

本病诊断综合考虑临床诊断病原学诊断血清学诊断和分子生物学诊断等方法作为疱疹病毒科

、、。

的其基因组容易发生重组与变异因此在鉴别诊断的时候参考多个靶基因对疫苗株与野毒株进

DEV,,,

行区分

。

Ⅳ

GB/T22332—2025

鸭病毒性肠炎诊断技术

1范围

本文件描述了鸭病毒性肠炎临床诊断和病毒分离鉴定中和试验直接免疫荧光间接酶联免疫吸

、、、

附试验聚合酶链式反应疫苗株与野毒株鉴别诊断荧光定量等实验室诊

(ELISA)、(PCR)、PCR、PCR

断方法

。

本文件适用于鸭病毒性肠炎的诊断检测监测和流行病学调查

、、。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

兽医诊断样品采集保存与运输技术规范

NY/T541、

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

。

绒毛尿囊膜

CAM:(ChorioallantoicMembrane)

鸡胚成纤维细胞

CEF:(ChickenEmbryoFibroblastCell)

细胞病变

CPE:(CytopathicEffect)

鸭胚成纤维细胞

DEF:(DuckEmbryoFibroblastCell)

鸭胚肾细胞

DEK:(DuckEmbryoKidneyCell)

鸭肠炎病毒

DEV:(DuckEnteritisVirus)

鸭瘟病毒

DPV:(DuckPlagueVirus)

鸭病毒性肠炎

DVE:(DuckVirusEnteritis)

酶联免疫吸附试验

ELISA:(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)

磷酸盐缓冲液

PBS:(PhosphateBufferSaline)

磷酸盐吐温缓冲液

PBST:(PhosphateBufferSalinewithTween-20)

聚合酶链式反应

PCR:(PolymeraseChainReaction)

无特定病原

SPF:(SpecificPathogenFree)

三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸

TAE:--(TrihydroxymethylAminomethane-aceticAcid-eth-

yleneDiaminetetraAceticAcid)

组织细胞半数感染量

TCID50:(MedianTissueCultureInfectiveDose)

1

GB/T22332—2025

5临床诊断

51流行病学

.

511自然条件下可感染鸭鹅和天鹅以及所有雁形目鸭科成员

..、。

512雏鸭至成年种鸭均可感染发病月龄以上多发成年鸭和产蛋母鸭发病死亡较重一年四季均

..。1,,

可发生

。

513自然感染的潜伏期一般为

..3d~4d。

514主要通过消化道感染交配眼结膜和呼吸道也可传染

..,、。

52临床症状

.

521鸭群突然出现持续性高死亡率病初体温升高以上呈稽留热

..,(43℃),。

522病鸭精神萎顿采食减少或停食饮欲增加头颈缩起羽毛松乱两翅下垂共济失调

..,,,,,,。

523病鸭头和颈部肿胀眼角膜浑浊流泪怕光流鼻液眼睑水肿常粘连或被干酪样分泌物覆

..,、、,,、

盖体表有散在出血斑

,。

524病鸭下痢水样腹泻排出草绿色或灰白色稀粪

..,,。

525成年鸭死亡时膘情良好死亡公鸭阴茎脱垂明显

..,。

526产蛋鸭群在死亡高峰期产蛋明显下降

..。

527周龄周龄商品鸭表现脱水消瘦喙发蓝结膜炎流泪鼻腔有渗出物和泄殖腔有血染

..2~7、,,、、。

528自然条件下鹅感染临床症状与鸭相似

..DEV,。

53病理变化

.

531剖检变化

..

5311病鸭头颈部皮下有不同程度的炎性水肿或黄色胶冻样物

...。

5312病鸭口腔黏膜出血坏死有黄色假膜附着

...、,。

5313食道条索状出血

...。

5314肠黏膜充血出血以十二指肠和直肠最为严重

...,。

5315发病鸭肝脏有点状出血和灰白坏死点交替出现

...。

5316发病鸭泄殖腔出血坏死水肿或溃疡黏膜表面覆盖一层灰褐色或绿色的坏死结痂

...、、,。

5317产蛋母鸭的卵泡以出血变形破裂或液化为特征后期引起腹膜炎

...、、,。

5318雏鸭感染法氏囊呈深红色表面有针尖状的坏死灶囊腔充满白色的凝固性渗出物

...DEV,,,。

532组织学变化

..

5321以血管壁损伤为主小静脉和微血管明显受损管壁内皮破裂

...,,。

5322肝细胞可见核内包涵体

...。

5323脾窦充满红细胞血管周围有凝固性坏死

...,。

5324食道和泄殖腔黏膜上皮细胞坏死脱落黏膜下层疏松水肿有淋巴样细胞浸润

...,、,。

5325胃肠黏膜消化道上皮细胞有嗜酸性核内包涵体

.../。

54结果判定

.

符合中的两条及以上且符合中的三条及以上和中的三条及以上的病例可判为疑似

5.1,5.25.3,

确诊应采集疑似病例的肝脾肾等组织或血清进行实验室诊断对临床特征性症状不明显的

DVE。、、。

2

GB/T22332—2025

病例也可采集肝脾肾等组织或血清进行实验室诊断

,、、。

6样品采集保存与处理

、

61仪器设备

.

611级生物安全柜

..Ⅱ。

612台式高速冷冻离心机

..。

613手术剪刀和镊子

..。

614压舌板

..。

615离心管

..2.0mL。

616样品保存管

..。

617组织研磨器

..。

618一次性注射器

..。

62试剂材料

.

621按照附录中的方法配制

..0.01mol/LPBS(pH7.4),AA.1。

622青霉素

..。

623链霉素

..。

63样品采集与保存

.

631采集与保存规范

..

样品采集与保存按照的规定进行

NY/T541。

632样品采集

..

6321发病早期无菌采集病鸭血液用压舌板刮取口腔伪膜及溃疡处黏液血液样品保存口

...,;。4℃,

腔伪膜及溃疡处黏液冷冻保存

-20℃。

6322发病中后期或动物死亡后无菌采集食管肝脾肾等组织样品装入样品保存管密封

...,、、、,,,

冷冻保存

-20℃。

64样品处理

.

641血液样品待凝固后离心分离出血清作为检测材料

..,,2000r/min10min,,。

642组织样品食管肝脾肾等用剪刀剪碎后按照质量体积比加入含青霉素

..(、、、),,1∶5~1∶10

和链霉素的用组织研磨器制成匀浆制成悬液反复冻融

4000IU/mL4000μg/mLPBS(pH7.4),,,

次次离心取上清直接作为检测材料或经滤器过滤除菌后作为接

2~3,10000r/min10min,0.45μm

种材料

。

7病毒分离鉴定

71仪器设备

.

711级生物安全柜

..Ⅱ。

712倒置生物显微镜

..。

713冰箱不同温度

..(2℃~8℃、-20℃、-70℃)。

3

GB/T22332—2025

714二氧化碳恒温培养箱

..。

715低速离心机

..(15mL、50mL)。

716微量可调移液器等不同规格

..(10μL、100μL、1000μL)。

717细胞培养瓶

..T25。

718烧杯

..(100mL)。

719水浴锅

..。

72试剂材料

.

721按照的方法配制

..0.01mol/LPBS(pH7.4),A.1。

722细胞生长液与细胞维持液按照和的方法配制

..,A.2A.3。

723细胞消化液按照的方法配制

..,A.4。

73试验细胞与动物

.

731鸭胚成纤维细胞制备方法见附录中

..(DEF),BB.1。

732日龄日龄鸭胚鸭胚或健康种鸭群无抗体

..9~12(SPF、DEV)。

733周龄周龄鸭或无母源抗体的易感鸭

..2~4SPFDEV。

74病毒分离方法

.

741细胞培养法

..

7411待细胞长成单层后先倒去细胞培养瓶中的营养液加入中处理好的接种材料置

...,,1mL6.4.2,

作用中间每隔晃动一下细胞培养瓶然后弃掉病料液维持液洗细胞面次再加

37℃60min,15min,,1,

细胞维持液体积分数二氧化碳培养箱培养对照细胞瓶不接种样品弃去营养液后

5mL,5%()37℃。,

加细胞维持液

5mL。

7412样品接种后于倒置显微镜下逐日观察至并记录若对照细胞正常而接种样品细胞出现

...,7d。,

细胞变圆聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等现象时冻融次转入新长满单层的细胞培养

,CPE,3

瓶如果仍出现类似且日渐明显则收获细胞培养物保存备用

,CPE,,-70℃。

7413样品接种后连续观察如果对照细胞与接种样品细胞均无变化冻融次后取转入

...,7d,,31mL

新长满单层的细胞培养瓶盲传代盲传过程中若出现按的方法收获细胞培养

,2。CPE,7.4.1.2,

物保存备用若未出现病毒分离为阴性

,-70℃。CPE,。

742鸭胚分离法

..

7421将中处理好的材料无菌接种于至少枚日龄日龄鸭胚的绒毛尿囊膜

...6.4.259~12(CAM)

上枚

,0.2mL/。

7422逐日照胚观察鸭胚死亡情况并记录弃去内死亡鸭胚检查内死亡鸭胚若呈现特征

...,24h,10d,

性的弥漫性出血收集及尿囊液进行鉴定

,CAM。

7423若鸭胚未死亡或死亡胚体无明显病变则将悬液盲传代继续观察胚体死亡及病变情

...,CAM2,

况并收集及尿囊液进行病毒鉴定

,CAM。

7424收集及悬液制备对人工气室上的卵壳进行消毒处理去除窗孔上的卵壳使用灭菌剪

...CAM:,。

刀沿人工气室的界限剪去卵壳及壳膜露出绒毛尿囊膜再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起用剪刀沿人

,,,

工气室边缘将膜剪下将剪下的置于尿囊液中经组织匀浆制成悬液

。CAM1mL。

743实验动物接种法

..

7431选取周龄周龄鸭或无母源抗体的易感鸭只平均分成两组一组用中制

...2~4SPF16,。6.4.2

4

GB/T22332—2025

备的接种材料进行肌肉接种每只另一组用同样剂量的进行肌肉接种隔离饲养作为

,0.5mL;PBS,

对照

。

7432接种后逐日观察至若对照组与接种组均无异常表现可判为病毒分离阴性

...12d。,。

7433若对照组正常接种组出现中临床症状或死亡病例立即进行剖检检查剖检可见中的

...,5.2,,5.3

病变收集病料进行病毒鉴定

,。

75结果判定

.

751细胞盲传代未见或鸭胚传代未见病变判为病毒分离阴性

..3CPE,。

752对出现的细胞培养液出现病变的鸭胚及尿囊液或接种后发病鸭的组织经第章

..CPE、CAM,8

或第章所述方法检测阳性者判为病毒分离阳性

10,。

8中和试验固定病毒-稀释血清法

()

81仪器设备

.

811级生物安全柜

..Ⅱ。

812移液器等不同规格

..(10μL、100μL、1000μL)。

813二氧化碳培养箱

..。

814一次性孔细胞培养板

..96。

815剪刀和镊子

..。

816平皿

..。

817烧杯

..。

82试剂材料

.

821日龄日龄鸭胚鸭胚或健康种鸭群无抗体

..18~20(SPF、DEV)。

822日龄日龄鸡胚

..9~11SPF。

823鸡胚成纤维细胞制备方法见

..(CEF),B.1。

824鸭胚肾细胞制备方法见

..(DEK),B.2。

825标准阳性血清灭活

..(56℃30min)。

826标准阴性血清

..。

827株采用细胞时

..DEVF34(DEK)。

828鸡胚适应毒采用细胞时

..DVE(CEF)。

83试验步骤

.

831TCID50测定

..

8311用维持液将病毒按-1-8进行倍系列稀释每个稀释度应更换一支吸头

...10~1010,。

8312弃去已长满单层的细胞培养板内的细胞液

...。

8313将稀释好的病毒液分别移入细胞培养板内的列列每个病毒稀释度重复孔每孔

...1~10,8,

第列第列不加病毒液作为正常细胞对照在移入病毒液时每个稀释度应更换吸头

100μL。11、12。,。

8314所有加入病毒液孔补加细胞维持液第列第列直接加入细胞维持液

...100μL,11、12200μL。

8315置于体积分数二氧化碳培养箱培养

...5%()37℃。

8316后开始记录情况以后每天观察一次记录孔数

...24hCPE,,CPE。

8317根据法计算出病毒的见附录

...Reed-MuenchTCID50(C)。

5

GB/T22332—2025

8318用细胞维持液配成每含个的病毒液

...100μL100TCID50。

832中和试验

..

8321将灭活的阳性对照血清阴性对照血清被检血清于孔细胞培养板中进行倍系列稀释共

...、、962,

进行个滴度稀释即血清样品每个稀释度重复个孔

8(1∶2~1∶256),4。

8322按与稀释血清等体积的量将配好的个的病毒液加入稀释好的孔

...,100TCID50。

8323于孔培养板上第列第列的孔孔中对的病毒液作倍梯度稀

...969~12A9~D12100TCID5010

释直至每个稀释度做个重复

,0.1TCID50,4。

8324在孔中加入维持液作细胞对照见附录

...E9~H12200μL,(D)。

8325将加好样品的孔板加盖后置于体积分数二氧化碳培养箱作用

...96,5%()37℃1h~1.5h。

8326弃去已长满单层的细胞培养板内的细胞液

...。

8327作用后吸取板中各孔液体对应加入已长满细胞单层的培养板中每孔再补加

...(100μL),100μL

细胞维持液使包括对照孔在内的所有孔中液体总量均为

,200μL。

8328加盖后置于体积分数二氧化碳培养箱培养

...,5%()37℃。

8329后在倒置显微镜下观察以后逐日观察并做好相应记录

...24hCPE,5d~7d,。

84试验成立条件

.

841对照孔细胞正常

..。

842阴性血清对照孔在以上稀释的各孔细胞都出现

..1∶2CPE。

843阳性血清对照孔呈现原有的抗体效价或误差不超过个滴度

..,1。

844病毒回归于孔均出现至少有一半孔出现有个别孔出

..100TCID50CPE,10TCID50CPE,1TCID50

现或不出现各孔均不出现

CPECPE,0.1TCID50CPE。

85结果判定

.

851被检血清在含以上稀释度的细胞孔均没有判为血清抗体阳性

..1∶8(1∶8)CPE,。

852被检血清在稀释度的细胞孔中有一半出现或以上稀释度有个别孔出现该

..1∶4CPE1∶8CPE,

样品暂判为可疑应重复试验再次出现可疑结果判为血清抗体阴性

,;,。

853被检血清在以上稀释度的各个细胞孔均出现判为血清抗体阴性

..1∶2CPE,。

9直接免疫荧光

91仪器设备

.

911级生物安全柜

..Ⅱ。

912荧光显微镜

..。

913移液器等不同规格

..(10μL、100μL、1000μL)。

914恒温箱

..37℃。

915孔细胞培养板

..6。

916盖玻片

..。

92试剂材料

.

921荧光标记的兔抗

..DEVIgG。

922细胞或细胞制备方法见附录

..DEF(DEK),B。

923细胞生长液和细胞维持液按照和的方法制备

..,A.2A.3。

6

GB/T22332—2025

924预冷丙酮

..-20℃。

925磷酸甘油溶液按照的方法制备

..,A.5。

93操作步骤

.

931细胞玻片的制作

..

将制备好的浓度约为5个的或细胞悬液加入装有盖玻片的孔培养

8.0×10/mLDEF(DEK)6

板每孔置于体积分数二氧化碳的培养箱中培养

,3mL,5%()37℃。

932接种病料

..

培养后盖玻片上细胞长满单层而且均匀分布时弃去孔中营养液每孔接种中

24h~48h,