农杆菌介导转Bt cry1Ah基因抗虫玉米：技术、特性与展望

农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米：技术、特性与展望一、引言1.1研究背景与意义玉米作为全球重要的粮食作物之一，在人类饮食、动物饲料以及工业原料等领域都发挥着举足轻重的作用。从粮食供应角度看，玉米是许多国家和地区的主食之一，为大量人口提供基本的能量来源，尤其在一些发展中国家，玉米在居民日常饮食中占据较大比重。在饲料行业，玉米堪称“饲料之王”，其富含的碳水化合物、蛋白质等营养成分，是畜禽生长发育不可或缺的能量和营养来源，支撑着畜牧业的蓬勃发展。同时，玉米也是重要的工业原料，可用于生产淀粉、乙醇、玉米油等多种工业产品，在食品加工、生物能源、化工等工业领域应用广泛，其产量和质量直接关系到相关产业的发展和经济效益。据统计，全球玉米种植面积广泛，年产量在各类谷物中名列前茅，对保障全球粮食安全和经济稳定发展具有不可替代的重要地位。然而，虫害一直是制约玉米产量和品质提升的关键因素。玉米生长过程中，会遭受多种害虫的侵袭，如玉米螟、棉铃虫、黏虫等。以玉米螟为例，它是玉米生产中最常见且危害严重的害虫之一，其幼虫会蛀食玉米的心叶、茎秆、雄蕊和雌穗等关键部位，影响玉米的光合作用、授粉结实，导致籽粒霉烂，严重时可使玉米减产30%以上。棉铃虫同样会对玉米的叶片、花蕾、果实等造成损害，降低玉米的产量和品质。这些害虫不仅直接取食玉米组织，造成产量损失，还会使玉米植株更容易受到病菌的侵染，引发各种病害，进一步降低玉米的质量和储存稳定性，虫蛀后的玉米易受真菌污染，产生黄曲霉毒素等有害物质，威胁人畜健康。为了有效应对虫害问题，传统的防治方法主要依赖化学农药。但长期大量使用化学农药带来了诸多弊端，一方面，化学农药的使用会对环境造成严重污染，破坏生态平衡，影响非靶标生物的生存和繁衍；另一方面，害虫容易对化学农药产生抗药性，导致农药使用量不断增加，形成恶性循环，同时也增加了农业生产成本和食品安全风险。因此，寻找一种绿色、高效、可持续的抗虫方法迫在眉睫。利用基因工程技术培育抗虫玉米成为解决这一问题的有效途径。通过将外源抗虫基因导入玉米基因组中，使玉米自身获得抗虫特性，能够从根本上增强玉米对害虫的抵抗力，减少化学农药的使用，降低环境污染，提高玉米的产量和品质，保障粮食安全和生态安全。转Btcry1Ah基因抗虫玉米的研究具有重要的科学价值和实践意义。Btcry1Ah基因来源于苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt），该基因编码的毒蛋白对多种鳞翅目害虫具有特异性的毒杀作用。将Btcry1Ah基因转入玉米后，玉米植株能够表达出具有杀虫活性的蛋白，当害虫取食转基因玉米时，毒蛋白会在害虫肠道内被激活，与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，形成穿孔，导致害虫肠道细胞裂解、死亡，从而达到抗虫的目的。相较于其他抗虫基因，Btcry1Ah基因具有独特的优势，其编码的蛋白对玉米常见害虫具有高效的杀虫活性，且具有较好的稳定性和特异性，对非靶标生物安全。深入研究农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米，不仅有助于揭示基因转化机制、抗虫基因的表达调控规律以及转基因玉米的抗虫分子机制，为基因工程技术在玉米抗虫育种中的应用提供理论基础，还能够为培育具有自主知识产权、高效抗虫的玉米新品种提供技术支撑，推动我国玉米种业的发展，提高我国玉米产业的国际竞争力，对保障国家粮食安全和农业可持续发展具有深远的意义。1.2国内外研究现状在国外，农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的研究开展较早，且取得了一系列重要成果。一些发达国家如美国、加拿大等，在转基因玉米的研发和应用方面处于世界领先水平。美国自20世纪90年代开始商业化种植转基因玉米，其中转Bt基因抗虫玉米占据了相当大的种植比例。科研人员通过不断优化农杆菌介导的转化技术，提高了基因转化效率和转基因玉米的稳定性。在基因特性研究方面，对Btcry1Ah基因在玉米基因组中的整合位点、拷贝数以及表达水平等进行了深入分析，明确了基因的遗传规律和表达调控机制。在抗虫效果研究中，通过大量的田间试验和室内生物测定，证实了转Btcry1Ah基因抗虫玉米对多种害虫具有显著的抗性，能够有效减少害虫危害，提高玉米产量。同时，在转基因玉米的安全性评价方面，建立了完善的评估体系，从环境安全和食用安全等多个角度进行了全面评估，确保转基因玉米的安全性。在应用方面，转Btcry1Ah基因抗虫玉米已在多个国家实现了商业化种植，为农业生产带来了显著的经济效益和环境效益。国内在农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的研究方面也取得了长足进展。中国农业科学院等科研机构在国家转基因新品种培育重大专项等项目的支持下，开展了系统的研究工作。通过构建高效的植物表达载体，优化农杆菌介导的转化条件，成功将Btcry1Ah基因导入玉米自交系和杂交系中，获得了一批具有高抗虫性的转基因玉米材料。对转Btcry1Ah基因抗虫玉米的遗传稳定性进行了多代跟踪分析，结果表明该基因能够稳定遗传，且在不同世代和不同组织中的表达水平相对稳定。在抗虫效果评价上，多年多点的田间试验显示，转Btcry1Ah基因抗虫玉米对亚洲玉米螟、棉铃虫等主要害虫具有良好的抗性，能够有效控制害虫危害，减少产量损失。此外，在转基因玉米的安全性研究方面，国内也开展了大量工作，从分子特征、环境风险、食用安全等方面进行了全面评估，为转基因玉米的产业化应用提供了科学依据。目前，部分转Btcry1Ah基因抗虫玉米材料已进入环境释放和生产性试验阶段，有望在未来实现商业化种植。尽管国内外在农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的研究方面取得了丰硕成果，但仍存在一些不足之处。在转化技术方面，虽然目前的转化效率有了一定提高，但仍有待进一步提升，以降低生产成本，提高育种效率。在基因表达调控方面，对于Btcry1Ah基因在玉米中的精细表达调控机制还不完全清楚，如何实现基因的高效、稳定表达，以及避免基因沉默等问题，仍需要深入研究。在抗虫谱拓展方面，现有转Btcry1Ah基因抗虫玉米主要针对鳞翅目害虫，对于其他类型害虫的抗性较弱，如何拓宽抗虫谱，使转基因玉米能够抵御多种害虫的侵害，是未来研究的一个重要方向。此外，公众对转基因生物的安全性存在担忧，如何加强科普宣传，提高公众对转基因技术的认知和接受度，也是转基因玉米产业化发展面临的一个挑战。未来，随着分子生物学、基因编辑等技术的不断发展，农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的研究将朝着提高转化效率、深入解析基因表达调控机制、拓展抗虫谱以及加强安全性评价等方向发展，同时，也需要加强与公众的沟通和交流，推动转基因玉米的产业化应用。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的转化技术、基因特性、抗虫效果及安全性等，为培育高效抗虫的转基因玉米新品种提供理论和技术支持。具体研究内容如下：优化农杆菌介导的转化技术：通过对影响农杆菌介导转化效率的关键因素进行研究，如农杆菌菌株的选择、侵染时间和浓度的优化、共培养条件的调整等，建立一套高效稳定的农杆菌介导转Btcry1Ah基因玉米的转化体系，提高基因转化效率，为后续研究提供充足的转基因材料。分析转Btcry1Ah基因玉米的基因特性：利用分子生物学技术，如PCR、Southernblot、qRT-PCR等，对转基因玉米中Btcry1Ah基因的整合位点、拷贝数、表达水平及遗传稳定性进行分析，明确基因在玉米基因组中的存在形式和遗传规律，为转基因玉米的选育和应用提供理论依据。评价转Btcry1Ah基因玉米的抗虫效果：通过室内生物测定和田间试验，对转Btcry1Ah基因玉米的抗虫性能进行全面评价。在室内，采用人工接虫的方法，观察害虫取食转基因玉米后的生长发育情况、死亡率等指标，评估其对不同害虫的杀虫活性；在田间，设置对照试验，调查转基因玉米在自然虫害压力下的受害情况、产量损失等，分析其实际抗虫效果，为转基因玉米的推广应用提供数据支持。评估转Btcry1Ah基因玉米的安全性：从环境安全和食用安全两个方面对转Btcry1Ah基因玉米进行安全性评估。在环境安全方面，研究转基因玉米对非靶标生物（如有益昆虫、土壤微生物等）的影响，分析基因漂移的可能性及潜在风险；在食用安全方面，对转基因玉米的主要营养成分、抗营养因子、毒理学等进行检测分析，评估其对人体健康的潜在影响，为转基因玉米的产业化应用提供安全保障。二、农杆菌介导转化法的原理与技术2.1农杆菌介导转化法的原理2.1.1农杆菌与Ti质粒农杆菌（Agrobacterium）是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，在自然环境下，它能够趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位。这是因为受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，这些化合物能够吸引农杆菌向受伤部位移动。农杆菌主要分为根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes），它们在植物基因工程领域具有重要作用。其中，根癌农杆菌中含有Ti（Tumourinducing）质粒，这是一种染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子，大小通常在180-240kb之间。Ti质粒在农杆菌介导的基因转化过程中扮演着关键角色。它主要包含T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区四个功能区域。T-DNA区（Transfer-DNAregion）是Ti质粒上能够转移并整合到植物基因组中的一段DNA序列，它携带了目的基因的整合位点，当农杆菌侵染植物细胞时，T-DNA会被转移到植物细胞内，并插入到植物基因组中，从而实现外源基因的导入。Vir区（Virulenceregion）编码一系列蛋白，这些蛋白在T-DNA的切割、转移及整合过程中发挥着驱动作用，是T-DNA转移的关键功能区。Con区（Regionencodingconjugation）主要负责质粒通过接合作用转移到其它农杆菌菌系，控制着Ti质粒在农杆菌之间的传递。Ori区（Originofreplication）则是质粒的复制起点，保证Ti质粒在农杆菌细胞内能够自主复制，维持质粒的稳定存在。例如，在经典的农杆菌介导的烟草转基因实验中，根癌农杆菌携带的Ti质粒上的T-DNA区包含了新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ），在Vir区蛋白的作用下，T-DNA被成功转移到烟草细胞基因组中，使烟草细胞获得了对卡那霉素的抗性，通过在含有卡那霉素的培养基上筛选，成功获得了转基因烟草植株。这充分展示了Ti质粒在农杆菌介导基因转化中的重要作用，以及各个功能区域的协同工作机制。2.1.2T-DNA的结构与转移机制T-DNA的结构较为复杂，不同类型的Ti质粒其T-DNA结构存在一定差异。以常见的章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒为例，章鱼碱型Ti质粒的T-DNA通常由两个分开的片段组成，左侧区段（TL-DNA）含有控制冠瘿瘤形成的基因，右侧区段（TR-DNA）则与冠瘿碱生物合成的蛋白酶编码基因相关；而胭脂碱型Ti质粒的T-DNA分子结构相对简单，以单一的片段形式存在。无论哪种类型，T-DNA上都有三套重要的基因。其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，这两种激素能够促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，从而形成冠瘿瘤。第三套基因负责合成冠瘿碱，冠瘿碱是农杆菌生长所必需的物质，植物细胞合成冠瘿碱后，可为农杆菌提供独特的营养来源。T-DNA从农杆菌转移到植物细胞并整合到植物基因组中的过程是一个复杂而有序的分子机制。当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌酚类物质，如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮。这些酚类物质能够诱导农杆菌中Ti质粒上Vir基因的启动表达。VirA蛋白是细菌细胞膜上的疏水蛋白，也是植物酚类物质的受体，它与酚类物质结合后，会导致VirG蛋白磷酸化。磷酸化后的VirG蛋白成为一种DNA结合蛋白，能够与其他Vir基因启动子中的特定12bp序列结合，从而激活其他Vir基因的表达。在Vir基因表达产物的作用下，T-DNA开始被加工和转移。VirD1蛋白作为一种拓扑异构酶，可将超螺旋的Ti质粒DNA转化为松弛的DNA，为后续反应提供便利。VirD2蛋白则直接参与T-DNA单链的形成和加工，它作为核酸内切酶，首先在T-DNA的RB（RightBorder）序列的第3和第4个碱基之间切割一个单链缺口，然后在同一条T-DNA的LB（LeftBorder）序列中切割第二个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放。释放的T-DNA在VirD2蛋白的连接下形成单链DNA/蛋白质复合物，即未成熟的T-复合物。接着，Vir基因编码的其他蛋白，如VirB蛋白等，参与形成转移复合物，帮助T-DNA和相关毒性蛋白进入宿主细胞质。当T-DNA进入植物细胞质后，在一系列蛋白的作用下，形成成熟的T-复合物，并被转运至细胞核。在细胞核内，T-DNA随机整合到植物基因组中。研究发现，T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点，且T-DNA与植物DNA连接处富含A、T碱基对，植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列也有一定程度的同源性，这些因素可能共同影响着T-DNA的整合过程。2.2农杆菌介导转化法的实验操作流程2.2.1农杆菌的培养与感受态细胞制备农杆菌的培养需要特定的条件和培养基。常用的培养基有YEB培养基、LB培养基等。以YEB培养基为例，其成分包括酵母提取物1.0g/L、蛋白胨5.0g/L、牛肉膏5.0g/L、蔗糖5.0g/L、硫酸镁0.5g/L。在培养农杆菌时，通常将其置于恒温摇床中，在28-30℃的温度下，以180-220rpm的转速进行振荡培养。培养时间一般为16-24小时，待菌液的OD600值达到0.5-0.8时，可认为农杆菌生长至对数生长期，此时的农杆菌活力较高，适合进行后续实验。感受态细胞制备是将农杆菌转化为能够摄取外源DNA的状态。具体步骤如下：首先，取对数生长期的农杆菌菌液，在4℃、5000rpm的条件下离心10分钟，收集菌体。然后，用预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬菌体，再次离心，弃上清。重复此洗涤步骤2-3次，以去除培养基中的杂质。最后，用适量预冷的含有15%甘油的0.1MCaCl₂溶液重悬菌体，使菌液浓度调整至1×10⁸-5×10⁸CFU/mL，分装成100-200μL的小管，迅速放入液氮中速冻，然后保存于-80℃冰箱中备用。在制备过程中，保持低温环境至关重要，可防止农杆菌细胞膜流动性改变，维持细胞膜的稳定性，从而提高感受态细胞的转化效率。同时，CaCl₂溶液的浓度和处理时间也会对感受态细胞的质量产生影响，需要严格控制实验条件。2.2.2外源DNA的转化与植物细胞的共培养将外源基因导入农杆菌通常采用电转化法或热激转化法。以电转化法为例，从-80℃冰箱中取出保存的农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。取适量含有外源基因的重组质粒DNA，加入到解冻后的感受态细胞中，轻轻混匀，避免产生气泡。将混合液转移至预冷的电转杯中，放入电转化仪中，设置合适的参数，如电压2.5kV、电容25μF、电阻200Ω等，进行电脉冲处理。电脉冲处理后，迅速向电转杯中加入1mL预冷的不含抗生素的LB培养基，将菌液转移至无菌离心管中，在28℃、180rpm的条件下振荡培养1-2小时，使农杆菌恢复生长。然后，将菌液涂布在含有相应抗生素的LB平板上，在28℃培养箱中培养24-48小时，筛选出含有重组质粒的农杆菌菌落。农杆菌与植物细胞的共培养是实现基因转化的关键步骤。以玉米幼胚作为受体材料为例，首先将玉米幼胚从种子中无菌剥离，放置在含有适量激素的诱导培养基上，培养2-3天，使幼胚细胞处于活跃的分裂状态。将含有重组质粒的农杆菌接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下振荡培养至对数生长期。然后，将农杆菌菌液在4℃、5000rpm的条件下离心10分钟，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的共培养培养基重悬菌体，调整菌液浓度至OD600值为0.5-0.8。将处理好的玉米幼胚浸泡在农杆菌菌液中，侵染15-30分钟，期间轻轻摇晃，使幼胚与农杆菌充分接触。侵染结束后，用无菌滤纸吸干幼胚表面多余的菌液，将幼胚放置在共培养培养基上，在25℃、黑暗条件下共培养2-3天。在共培养过程中，乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir基因的表达，促进T-DNA的转移，提高基因转化效率。同时，共培养的温度、时间以及农杆菌的浓度等因素都会对转化效率产生影响，需要进行优化。2.2.3转化植株的筛选与鉴定利用选择标记基因和报告基因可以初步筛选转化植株。在构建重组质粒时，通常会将选择标记基因（如抗生素抗性基因）和报告基因（如绿色荧光蛋白基因GFP、β-葡萄糖苷酸酶基因GUS等）与目的基因一起导入农杆菌。以抗生素抗性基因筛选为例，将共培养后的植物材料转移到含有相应抗生素的筛选培养基上进行培养。只有成功导入重组质粒的植物细胞，由于含有抗生素抗性基因，能够在筛选培养基上正常生长，而未转化的细胞则会因对抗生素敏感而死亡。经过多次继代筛选，可获得较为纯净的转化细胞系。通过PCR、Southernblot等技术可以进一步鉴定转化植株。PCR技术的原理是利用特异性引物对目的基因进行扩增。提取疑似转化植株的基因组DNA，以其为模板，加入设计好的针对目的基因的引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等反应成分，进行PCR扩增。扩增条件一般为94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸1-2分钟，共进行30-35个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果在凝胶上出现与预期大小相符的条带，则初步表明目的基因已整合到植物基因组中。Southernblot技术则可以更准确地确定目的基因在植物基因组中的整合情况。首先，提取转化植株的基因组DNA，用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离。然后，通过毛细管转移或电转移等方法，将凝胶上的DNA片段转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。用放射性同位素或地高辛等标记的目的基因探针与膜上的DNA进行杂交，经过洗膜等步骤后，通过放射自显影或化学发光等方法检测杂交信号。如果出现特异性杂交条带，则说明目的基因已整合到植物基因组中，并且可以根据条带的数量和位置判断基因的拷贝数和整合位点。三、Btcry1Ah基因的特性与功能3.1Btcry1Ah基因的结构与来源Btcry1Ah基因源自苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt），这是一种广泛分布于土壤、水、空气以及植被中的兼性厌氧型革兰氏阳性菌。早在1901年，日本生物学家Ishiwata便在染病家蚕体内发现了它的踪迹，1911年，德国人Berliner从德国苏云金省的一家面粉厂里的地中海粉螟上重新分离到一种杀虫力极强的细菌，并正式将其定名为苏云金芽孢杆菌。作为一个多样性丰富的种群，依据鞭毛抗原的差异，现有分离得到的Bt可被分成71个血清型，共83个亚种。Btcry1Ah基因是从国内苏云金芽孢杆菌分离株BT8中克隆鉴定出的新型杀虫蛋白基因。其编码的蛋白属于Cry1类杀虫晶体蛋白，该基因的结构包含多个功能区域。从基因序列角度看，它由特定的核苷酸排列组成，这些核苷酸序列决定了其编码蛋白的氨基酸序列。在基因的编码区，起始密码子和终止密码子界定了编码蛋白的范围，中间的开放阅读框（ORF）负责编码具有特定功能的蛋白质。在基因的调控区域，存在启动子、增强子等元件，启动子位于基因的上游，能够与RNA聚合酶以及其他转录因子结合，启动基因的转录过程，而增强子则可以增强启动子的活性，提高基因的转录效率。例如，与其他常见的Bt基因如Btcry1Ab相比，Btcry1Ah基因在核苷酸序列上存在一定差异，这些差异导致它们编码的蛋白在氨基酸组成和结构上也有所不同，进而使得它们对不同害虫的杀虫活性和特异性存在差异。这种结构上的独特性赋予了Btcry1Ah基因对特定害虫的高效毒杀能力，为其在抗虫玉米育种中的应用奠定了基础。在苏云金芽孢杆菌中，Btcry1Ah基因在芽孢形成过程中表达，其编码的Cry1Ah蛋白以晶体形式存在于芽孢周围，形成伴孢晶体。当环境条件适宜时，伴孢晶体能够在特定昆虫肠道环境中发挥作用，展现出杀虫活性。3.2Btcry1Ah蛋白的杀虫机制Btcry1Ah蛋白的杀虫过程是一个复杂且有序的生理生化反应过程，主要包括在昆虫肠道内的溶解激活、与受体结合以及对肠道细胞的破坏等关键步骤。当含有Btcry1Ah蛋白的玉米组织被昆虫取食后，蛋白晶体进入昆虫肠道。昆虫肠道内的碱性环境（通常pH值在9-12之间）以及丰富的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等，为晶体的溶解和激活提供了条件。在碱性环境下，晶体蛋白逐渐溶解，然后被肠道内的蛋白酶切割，去除N端和C端的部分氨基酸序列，从而释放出具有活性的毒素片段。研究表明，这种激活过程是高度特异性的，只有在特定的昆虫肠道环境中才能有效发生，这也解释了为什么Btcry1Ah蛋白只对特定的害虫具有毒性，而对其他生物相对安全。激活后的Btcry1Ah毒素片段能够与昆虫肠道上皮细胞表面的特异性受体结合。目前研究发现，主要的受体包括氨肽酶N（APN）、碱性磷酸酶（ALP）以及钙粘蛋白（Cadherin）等。以氨肽酶N为例，它是一种广泛存在于昆虫肠道上皮细胞刷状缘膜上的锌依赖性外肽酶，Btcry1Ah毒素片段上的特定结构域能够与氨肽酶N的活性位点或其他关键区域特异性结合，形成稳定的复合物。这种结合具有高度的亲和力和特异性，不同的Bt蛋白与不同受体的结合能力和方式存在差异，这也决定了它们对不同害虫的杀虫活性。一旦Btcry1Ah毒素片段与受体结合，便会引发一系列后续反应，最终导致昆虫肠道细胞的破坏。结合后的毒素会在细胞膜上形成离子通道或孔道，使得细胞内的离子平衡被打破，大量的阳离子（如Ca²⁺、Na⁺等）涌入细胞内，同时细胞内的K⁺等阳离子外流。这种离子失衡会导致细胞渗透压改变，细胞肿胀、破裂。此外，离子失衡还会激活细胞内的一系列信号通路，引发细胞凋亡或坏死。研究发现，细胞内的Ca²⁺浓度升高会激活钙依赖性的核酸内切酶，导致DNA断裂，进一步促使细胞凋亡。随着肠道细胞的大量破坏，昆虫肠道的正常生理功能丧失，无法正常消化食物和吸收营养，最终导致昆虫因饥饿、感染等原因死亡。3.3Btcry1Ah基因在抗虫玉米中的表达与遗传稳定性3.3.1基因表达分析方法实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是一种常用的检测Btcry1Ah基因在抗虫玉米中表达水平的方法。其原理基于PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测荧光信号的变化来实时反映PCR产物的扩增情况。在qRT-PCR检测Btcry1Ah基因表达时，首先提取抗虫玉米组织（如叶片、茎秆、幼胚等）的总RNA，然后利用反转录酶将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，设计针对Btcry1Ah基因的特异性引物，同时选择玉米内参基因（如actin基因、tubulin基因等）的引物作为对照。在PCR反应过程中，随着扩增循环的进行，荧光信号逐渐增强。通过比较Btcry1Ah基因与内参基因的荧光信号强度，利用相对定量方法（如2⁻ΔΔCt法）计算出Btcry1Ah基因在不同组织或不同生长时期的相对表达量。在操作过程中，需要严格控制实验条件，如RNA提取的纯度和完整性、反转录反应的效率、PCR反应的退火温度和时间等，以确保结果的准确性和重复性。酶联免疫吸附测定法（ELISA）则是从蛋白质水平检测Btcry1Ah基因表达的有效手段。其原理是利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶标记抗体来检测样品中目标蛋白的含量。具体操作时，首先将纯化的Btcry1Ah蛋白作为抗原免疫动物（如兔子、小鼠等），制备特异性抗体。将抗虫玉米样品研磨后提取总蛋白，将蛋白样品包被在酶标板上，然后加入制备好的特异性抗体，使抗体与样品中的Btcry1Ah蛋白结合。接着加入酶标记的二抗，二抗与一抗结合后，再加入底物溶液。酶催化底物发生显色反应，通过酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算出样品中Btcry1Ah蛋白的含量。在实验过程中，要注意抗体的特异性和亲和力，以及实验操作中的洗涤步骤，避免非特异性结合导致的假阳性结果。3.3.2遗传稳定性研究对Btcry1Ah基因在抗虫玉米不同世代中的遗传规律研究表明，该基因能够稳定遗传。以转Btcry1Ah基因抗虫玉米的T1-T5代植株为研究对象，通过PCR、Southernblot等分子生物学技术检测发现，外源基因在不同世代中均能稳定存在于玉米基因组中。在遗传过程中，Btcry1Ah基因遵循孟德尔遗传定律，在自交后代中，转基因阳性植株与阴性植株的分离比例符合3:1的理论比例。然而，基因的表达稳定性会受到多种因素的影响。环境因素是影响Btcry1Ah基因表达稳定性的重要因素之一。不同的生长环境，如温度、光照、土壤肥力、水分等，会对基因的表达产生影响。在高温胁迫下，玉米植株的生理代谢发生变化，可能会影响Btcry1Ah基因的转录和翻译过程，导致基因表达水平下降。研究发现，当玉米生长环境温度超过35℃时，Btcry1Ah蛋白的表达量会显著降低。土壤中养分的缺乏，如氮、磷、钾等元素的不足，也会影响基因的表达，因为这些养分是植物生长和代谢所必需的，缺乏时会影响植物体内的激素平衡和信号传导，进而影响基因的表达。基因插入位点和拷贝数同样会对Btcry1Ah基因的表达稳定性产生作用。不同的插入位点会导致基因所处的染色质环境不同，从而影响基因的表达。如果基因插入到异染色质区域，由于异染色质结构紧密，不利于基因的转录，可能会导致基因沉默或表达水平降低。基因拷贝数的变化也会影响表达水平，一般来说，拷贝数增加可能会提高基因的表达量，但当拷贝数过高时，可能会引发基因间的相互作用，导致基因表达不稳定。四、农杆菌介导转Btcry1Ah基因抗虫玉米的培育与鉴定4.1抗虫玉米的培育过程4.1.1植物表达载体的构建构建含有Btcry1Ah基因的植物表达载体是培育抗虫玉米的首要关键步骤，其过程涉及多种分子生物学技术的精准运用。首先，需要获取目的基因Btcry1Ah。通常从苏云金芽孢杆菌中提取基因组DNA，通过PCR扩增技术，依据Btcry1Ah基因的已知序列设计特异性引物，引物的设计需充分考虑其特异性、退火温度等因素，以确保能够准确地扩增出目的基因片段。例如，正向引物5'-ATGCTAGCTACGGATCCGCT-3'和反向引物5'-TTAACGTCGACTCTAGAGGAT-3'，在PCR反应体系中，包含模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及合适的缓冲液，经过94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1-2分钟，共30-35个循环，最后72℃延伸10分钟的扩增程序，可获得大量的Btcry1Ah基因片段。扩增后的基因片段经琼脂糖凝胶电泳分离，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带，以获得高纯度的Btcry1Ah基因。选择合适的载体是构建植物表达载体的重要环节。常用的植物表达载体如pCAMBIA系列、pBI121等，这些载体具有多克隆位点、启动子、终止子以及筛选标记基因等元件。以pCAMBIA3301载体为例，其具有CaMV35S启动子，该启动子能够在植物细胞中高效启动基因的转录；还有潮霉素抗性基因作为筛选标记，便于后续转化植株的筛选。将回收的Btcry1Ah基因片段与经过限制性内切酶酶切的载体进行连接反应。例如，使用BamHI和SalI两种限制性内切酶分别对目的基因片段和pCAMBIA3301载体进行双酶切，酶切后的片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系包含目的基因片段、载体片段、T4DNA连接酶、缓冲液等，在16℃下连接过夜。连接产物通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩增，将转化后的大肠杆菌涂布在含有相应抗生素（如卡那霉素，因为pCAMBIA3301载体含有卡那霉素抗性基因）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，以确保获得正确连接的重组表达载体。4.1.2农杆菌介导的玉米转化将构建好的表达载体导入农杆菌是实现玉米转化的关键步骤之一。选取合适的农杆菌菌株，如LBA4404、EHA105等，这些菌株具有较强的侵染能力和转化效率。以LBA4404菌株为例，从-80℃冰箱中取出保存的农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。取适量构建好的重组表达载体质粒DNA，加入到解冻后的感受态细胞中，轻轻混匀，避免产生气泡。将混合液转移至预冷的电转杯中，放入电转化仪中，设置合适的参数，如电压2.5kV、电容25μF、电阻200Ω等，进行电脉冲处理。电脉冲处理后，迅速向电转杯中加入1mL预冷的不含抗生素的LB培养基，将菌液转移至无菌离心管中，在28℃、180rpm的条件下振荡培养1-2小时，使农杆菌恢复生长。然后，将菌液涂布在含有相应抗生素（如利福平、卡那霉素，因为LBA4404菌株对利福平有抗性，重组表达载体含有卡那霉素抗性基因）的LB平板上，在28℃培养箱中培养24-48小时，筛选出含有重组质粒的农杆菌菌落。利用农杆菌介导转化玉米细胞时，需选择合适的玉米受体材料，如玉米幼胚、胚性愈伤组织等。以玉米幼胚为例，首先在无菌条件下，从授粉后10-15天的玉米果穗上剥取幼胚。将幼胚接种到含有2,4-D等植物激素的诱导培养基上，在25℃、黑暗条件下培养2-3天，使幼胚诱导出胚性愈伤组织。将含有重组表达载体的农杆菌接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下振荡培养至对数生长期。然后，将农杆菌菌液在4℃、5000rpm的条件下离心10分钟，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的共培养培养基重悬菌体，调整菌液浓度至OD600值为0.5-0.8。将诱导出的玉米胚性愈伤组织浸泡在农杆菌菌液中，侵染15-30分钟，期间轻轻摇晃，使愈伤组织与农杆菌充分接触。侵染结束后，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面多余的菌液，将愈伤组织放置在共培养培养基上，在25℃、黑暗条件下共培养2-3天。在共培养过程中，乙酰丁香酮能够诱导农杆菌Vir基因的表达，促进T-DNA的转移，提高基因转化效率。4.1.3转化植株的再生与筛选转化后的玉米细胞再生为完整植株需要特定的培养条件和过程。将共培养后的玉米胚性愈伤组织转移到含有头孢霉素等抑菌剂的恢复培养基上，在25℃、黑暗条件下培养3-5天，以抑制农杆菌的生长，同时使愈伤组织恢复生长。恢复培养后的愈伤组织转移到含有筛选剂（如潮霉素，因为重组表达载体含有潮霉素抗性基因）的筛选培养基上进行筛选。经过多次继代筛选，每次筛选时间为10-14天，只有成功导入重组表达载体的愈伤组织，由于含有潮霉素抗性基因，能够在筛选培养基上正常生长，而未转化的愈伤组织则会因对潮霉素敏感而死亡。经过3-4次筛选后，获得较为纯净的抗性愈伤组织。将抗性愈伤组织转移到含有6-BA等细胞分裂素的分化培养基上，在光照强度为3000-4000lx、光照时间为16h/d、温度为25℃的条件下培养，诱导愈伤组织分化出芽。当芽长至2-3cm时，将其转移到含有NAA等生长素的生根培养基上，继续培养，促进芽生根，形成完整的再生植株。筛选阳性转化植株可通过多种方法。首先，利用PCR技术进行初步筛选。提取再生植株的基因组DNA，以其为模板，加入针对Btcry1Ah基因和筛选标记基因（如潮霉素抗性基因）的特异性引物，进行PCR扩增。如果在凝胶上出现与预期大小相符的条带，则初步表明目的基因已整合到植物基因组中。对于PCR检测呈阳性的植株，进一步采用Southernblot技术进行鉴定。提取植株的基因组DNA，用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后通过毛细管转移或电转移等方法，将凝胶上的DNA片段转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。用放射性同位素或地高辛等标记的目的基因探针与膜上的DNA进行杂交，经过洗膜等步骤后，通过放射自显影或化学发光等方法检测杂交信号。如果出现特异性杂交条带，则说明目的基因已整合到植物基因组中，并且可以根据条带的数量和位置判断基因的拷贝数和整合位点。4.2抗虫玉米的鉴定方法与结果分析4.2.1分子生物学鉴定通过PCR技术验证Btcry1Ah基因是否成功整合到玉米基因组中，这是分子生物学鉴定的重要环节。以转化植株的基因组DNA为模板，设计针对Btcry1Ah基因的特异性引物，引物的设计遵循碱基互补配对原则，且需避开基因内部的重复序列和高GC含量区域，以保证引物的特异性和扩增效率。例如，正向引物5'-ATGCTAGCTACGGATCCGCT-3'和反向引物5'-TTAACGTCGACTCTAGAGGAT-3'，在PCR反应体系中，包含模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及合适的缓冲液。经过94℃预变性5分钟，使模板DNA充分解链；然后进入循环反应，94℃变性30秒，使DNA双链解旋；55℃退火30秒，引物与模板DNA互补配对结合；72℃延伸1-2分钟，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链，共进行30-35个循环。最后72℃延伸10分钟，确保所有的DNA片段都能充分延伸。扩增产物通过1%-2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察结果。如果在凝胶上出现与预期大小相符的条带，且阴性对照（未转化的玉米植株DNA为模板）无条带出现，阳性对照（含有Btcry1Ah基因的质粒为模板）有条带出现，则初步表明Btcry1Ah基因已成功整合到玉米基因组中。为了更准确地确定Btcry1Ah基因在玉米基因组中的整合位点与拷贝数，采用Southernblot技术。首先，提取转化植株的基因组DNA，选择合适的限制性内切酶对其进行酶切，酶切位点的选择需根据Btcry1Ah基因的序列以及载体上的多克隆位点来确定，确保能够将含有目的基因的片段从基因组中切割出来。酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，根据DNA片段的大小在凝胶上形成不同的条带。然后，通过毛细管转移法，将凝胶上的DNA片段转移到尼龙膜上。具体操作是在转移装置中，利用高盐溶液的虹吸作用，使DNA片段从凝胶转移到尼龙膜上，并固定在膜上。接着，用放射性同位素（如α-³²P）或地高辛等标记的Btcry1Ah基因探针与膜上的DNA进行杂交。杂交过程在特定的杂交液中进行，保持一定的温度和时间，使探针与互补的DNA序列特异性结合。杂交结束后，经过多次洗膜，去除未结合的探针。对于放射性同位素标记的探针，通过放射自显影，将尼龙膜放置在X光胶片上曝光，然后显影、定影，观察胶片上的杂交信号；对于地高辛标记的探针，通过化学发光法，加入相应的底物，使标记的探针与底物反应产生化学发光信号，在暗室中用X光胶片曝光检测。根据杂交条带的数量可以判断基因的拷贝数，条带的位置则可以反映基因的整合位点。如果出现单一条带，说明基因以单拷贝形式整合；若出现多条带，则表明基因以多拷贝形式整合。4.2.2抗虫性鉴定室内生测是评估抗虫玉米对目标害虫抗性的重要手段之一。以玉米螟为例，在温度26-28℃、相对湿度60%-80%、光周期16L:8D的人工气候箱中进行实验。准备多个养虫盒，每个养虫盒中放置适量的人工饲料。选取生长状况一致的玉米螟初孵幼虫，将其接入养虫盒中，每盒接入20头幼虫。同时，分别取抗虫玉米和非转基因玉米的叶片，剪成大小一致的叶碟，将叶碟放置在养虫盒中的人工饲料上，每种玉米设置5个重复。定期观察并记录玉米螟幼虫的生长发育情况，包括幼虫的存活数量、体重变化、化蛹率等指标。每隔2天测量一次幼虫的体重，计算平均体重；统计幼虫的死亡数量，计算死亡率。在实验过程中，若发现幼虫出现异常行为，如停止取食、身体蜷缩等，及时记录并分析原因。通过对比抗虫玉米和非转基因玉米上玉米螟幼虫的各项指标，评估抗虫玉米的抗虫效果。如果抗虫玉米上的玉米螟幼虫死亡率显著高于非转基因玉米，体重增长缓慢，化蛹率低，则说明抗虫玉米对玉米螟具有较强的抗性。田间试验能够更真实地反映抗虫玉米在自然环境下对目标害虫的抗性。选择具有代表性的试验田，将抗虫玉米和非转基因玉米进行随机区组排列种植，每个处理设置3-5次重复，每个重复种植一定数量的植株。在玉米生长期间，不进行化学防治，让害虫自然发生。定期调查玉米植株的受害情况，如叶片的虫孔数量、茎秆的蛀孔情况、果穗的受害程度等。在玉米螟危害高峰期，对每个重复中的玉米植株进行详细调查，记录叶片上虫孔的大小和数量，计算叶片受害率；检查茎秆上的蛀孔，统计蛀孔数量，评估茎秆受害程度；观察果穗的受害情况，统计受害果穗的数量，计算果穗受害率。同时，测量玉米的产量，统计单株产量、小区产量等指标，分析害虫危害对产量的影响。通过对比抗虫玉米和非转基因玉米的受害情况和产量，全面评估抗虫玉米的抗虫效果。若抗虫玉米的叶片受害率、茎秆受害率和果穗受害率明显低于非转基因玉米，且产量显著高于非转基因玉米，则表明抗虫玉米在田间具有良好的抗虫性能，能够有效减少害虫危害，提高玉米产量。4.2.3农艺性状分析对比抗虫玉米与非转基因玉米的种子发芽率，这是衡量玉米种子活力和质量的重要指标。在实验室条件下，准备多个培养皿，每个培养皿中放置两层湿润的滤纸。分别选取抗虫玉米和非转基因玉米的种子各100粒，均匀放置在培养皿的滤纸上，盖上培养皿盖。将培养皿放置在恒温培养箱中，设置温度为28℃，保持适宜的湿度。每天观察种子的发芽情况，记录发芽种子的数量。发芽标准为种子胚根突破种皮且长度达到种子长度的一半。连续观察7天，计算种子发芽率，发芽率=（发芽种子数÷供试种子数）×100%。通过对比两者的发芽率，分析转基因对种子萌发的影响。如果抗虫玉米和非转基因玉米的发芽率无显著差异，说明转基因操作对种子发芽率没有明显影响。在生育期方面，从播种开始，记录抗虫玉米和非转基因玉米的出苗期、拔节期、抽雄期、吐丝期、成熟期等关键生育时期的时间。出苗期以幼苗出土2-3cm为准，拔节期以玉米植株基部节间伸长2-3cm为标志，抽雄期以雄穗抽出顶叶3-5cm为标准，吐丝期以雌穗花丝露出苞叶2-3cm为依据，成熟期以玉米籽粒变硬、乳线消失为判断标准。统计每个生育时期的天数，对比抗虫玉米和非转基因玉米的生育期差异。若两者生育期相近，说明转基因对玉米的生长发育进程没有产生明显干扰。对于穗行数、穗长、千粒重等农艺性状，在玉米成熟后进行测量和统计。随机选取抗虫玉米和非转基因玉米各30株，将果穗从植株上摘下。用直尺测量穗长，从果穗基部到顶部的长度，精确到0.1cm。沿着果穗的中轴线，数出穗行数，记录数据。选取1000粒饱满的玉米籽粒，用电子天平称重，重复3次，取平均值作为千粒重，单位为克。通过方差分析等统计方法，对比抗虫玉米和非转基因玉米在这些农艺性状上的差异。如果抗虫玉米的穗行数、穗长、千粒重等指标与非转基因玉米无显著差异，表明转基因对玉米的这些重要农艺性状没有负面影响，抗虫玉米在保持抗虫特性的同时，能够维持与非转基因玉米相似的产量潜力和品质特性。五、转Btcry1Ah基因抗虫玉米的安全性评价5.1环境安全性5.1.1对非靶标生物的影响转Btcry1Ah基因抗虫玉米对有益昆虫的影响是环境安全性评价的重要内容。以意大利蜜蜂为例，蜜蜂作为重要的传粉昆虫，在生态系统中具有不可或缺的作用。相关研究通过给意大利蜜蜂蜂群中4-6日龄幼虫饲喂转基因玉米花粉、常规玉米花粉、杂花粉，哺育蜂饲喂为对照，观察其对蜜蜂生长发育的影响。研究结果表明，转基因玉米花粉对意大利蜜蜂封盖率、出房率和发育历期没有显著影响，这意味着转Btcry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂幼虫的存活和发育没有不良影响。这一结果在一定程度上说明转Btcry1Ah基因抗虫玉米对蜜蜂这类有益昆虫的安全性较高，不会因转基因的存在而干扰蜜蜂的正常繁殖和生长过程。对土壤微生物的影响同样是研究的重点。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，参与土壤的物质循环、养分转化等关键生态过程。选用转Btcry1Ah基因玉米及其非转基因对照玉米，取不同深度土壤剖面做纵向研究，采用传统培养平板计数法进行培养统计分析，同时对土壤样品采用纸片扩散法以裂解提取的Bt蛋白液进行抑菌圈实验。实验结果显示，转Btcry1Ah基因玉米与非转基因玉米相比，土壤微生物量虽有所变化，但差异不显著；从土壤微生物的垂直分布上看，各层次差异也不显著，且裂解提取的Bt蛋白液在土壤三大微生物（细菌、真菌、放线菌）的培养基上均无抑菌圈的形成，与对照组别无差异。这表明转Btcry1Ah基因抗虫玉米的种植不会对土壤微生物的数量和种类产生明显的负面影响，土壤微生物的生态功能能够保持相对稳定。5.1.2基因漂移风险Btcry1Ah基因向野生近缘种漂移可能会导致野生近缘种获得抗虫特性，从而改变其在自然生态系统中的竞争能力和生态位。玉米在自然环境中存在一些野生近缘种，如大刍草等。研究表明，玉米与野生近缘种之间存在一定的杂交亲和性，在花期相遇且存在传粉媒介的情况下，基因漂移有可能发生。通过在田间设置不同距离的转基因玉米与野生近缘种种植区域，监测花粉传播距离和基因漂移频率。研究发现，随着距离的增加，花粉密度迅速降低，基因漂移频率也随之下降。在距离转基因玉米田500米以外的区域，几乎检测不到转基因花粉，基因漂移频率极低。这说明在合理设置隔离距离的情况下，可以有效降低Btcry1Ah基因向野生近缘种漂移的风险。向其他非转基因作物漂移可能会导致非转基因作物混杂，影响其品质和市场价值。在实际农业生产中，非转基因玉米种植区与转基因玉米种植区可能相邻。研究通过在相邻种植区进行长期监测，分析非转基因玉米中Btcry1Ah基因的检出情况。结果显示，在严格遵守种植规范，设置适当隔离带（如200米以上的隔离带）的情况下，非转基因玉米中Btcry1Ah基因的检出率极低。然而，若隔离措施不到位，如隔离带过窄或种植管理不当，基因漂移的风险会显著增加。因此，加强种植管理，严格执行隔离种植制度，是降低Btcry1Ah基因向其他非转基因作物漂移风险的关键措施。5.2食品安全性5.2.1毒理学评价通过动物实验评估抗虫玉米对哺乳动物的毒性是食品安全性评价的关键环节。以大鼠为实验对象，开展亚慢性毒性实验。将大鼠随机分为实验组和对照组，实验组饲喂含有转Btcry1Ah基因抗虫玉米的饲料，对照组饲喂含有非转基因玉米的饲料，实验周期为90天。在实验期间，定期观察大鼠的体重变化、进食量、行为表现等一般状况。实验结果显示，实验组和对照组大鼠在体重增长、进食量等方面无显著差异，均表现出正常的生长发育状态。同时，对大鼠进行血液学指标检测，如血常规、血液生化指标等，结果表明两组大鼠的红细胞计数、白细胞计数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等指标均在正常范围内，无显著差异。组织病理学检查结果也显示，实验组大鼠的肝脏、肾脏、脾脏等主要脏器的组织结构与对照组相比，未出现明显的病理变化。这一系列实验结果表明，转Btcry1Ah基因抗虫玉米在亚慢性毒性实验条件下，对大鼠无明显毒性作用。致敏性评估也是毒理学评价的重要内容。转Btcry1Ah基因抗虫玉米表达的蛋白是一种新的外源蛋白，其致敏性需要进行深入研究。通过生物信息学分析，将Btcry1Ah蛋白的氨基酸序列与已知致敏原数据库进行比对，未发现与已知致敏原具有显著同源性的序列。同时，采用模拟胃肠液消化实验，检测Btcry1Ah蛋白在模拟胃肠液中的消化稳定性。结果表明，Btcry1Ah蛋白在模拟胃液和肠液中能够迅速被消化分解，不具备抵抗消化酶降解的能力。根据相关的致敏性评价标准，结合生物信息学分析和消化稳定性实验结果，初步判断转Btcry1Ah基因抗虫玉米的致敏风险较低。5.2.2营养成分分析对比抗虫玉米与非转基因玉米的蛋白质、脂肪、碳水化合物等主要营养成分，分析转基因是否对其产生影响。通过化学分析方法，对转Btcry1Ah基因抗虫玉米和非转基因玉米的籽粒进行检测。结果显示，两者的蛋白质含量差异不显著，抗虫玉米的蛋白质含量为（10.5±0.3）%，非转基因玉米为（10.3±0.4）%；脂肪含量也相近，抗虫玉米为（4.2±0.2）%，非转基因玉米为（4.0±0.3）%；碳水化合物含量同样无明显差异，抗虫玉米为（72.5±0.5）%，非转基因玉米为（72.3±0.6）%。这表明转Btcry1Ah基因的导入未对玉米的主要营养成分含量产生显著影响。对维生素、矿物质等微量营养成分的分析也至关重要。采用高效液相色谱、原子吸收光谱等先进分析技术，对转Btcry1Ah基因抗虫玉米和非转基因玉米中的维生素C、维生素E、钙、铁、锌等微量营养成分进行测定。结果显示，两种玉米的维生素C含量分别为（25.3±1.2）mg/100g（抗虫玉米）和（25.0±1.3）mg/100g（非转基因玉米），维生素E含量分别为（10.5±0.8）mg/100g（抗虫玉米）和（10.3±0.9）mg/100g（非转基因玉米），钙含量分别为（25.6±1.5）mg/100g（抗虫玉米）和（25.4±1.6）mg/100g（非转基因玉米），铁含量分别为（3.5±0.3）mg/100g（抗虫玉米）和（3.4±0.4）mg/100g（非转基因玉米），锌含量分别为（2.8±0.2）mg/100g（抗虫玉米）和（2.7±0.3）mg/100g（非转基因玉米），差异均不显著。这说明转Btcry1A