食品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）的液相-质谱检测实验报告

食品中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）的液相-质谱检测实验报告1.实验部分1.1仪器与试剂本次实验采用ThermoFisherTSQQuantiva三重四极杆液相色谱-串联质谱仪，配备电喷雾电离（ESI）源、UltiMate3000高效液相色谱系统（包括二元高压泵、自动进样器、柱温箱）；MettlerToledoXPE205电子分析天平（精度0.01mg）；KQ-500DE数控超声波清洗器；Sigma3-18K高速冷冻离心机；MilliporeMilli-Q超纯水仪。环己基氨基磺酸钠标准品（纯度≥99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国FisherScientific公司）；甲酸、乙酸铵为质谱级（美国Sigma-Aldrich公司）；实验用水为超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）；0.22μm有机相针式滤器（上海安谱实验科技股份有限公司）；石墨化碳黑固相萃取小柱（500mg/6mL，美国Waters公司）。实验样品涵盖市售常见食品类别：碳酸饮料、果汁饮料、蜜饯、糕点、酱腌菜、冷冻饮品共6类，总计42份样品，均采购于本地大型超市及农贸市场。1.2标准溶液配制准确称取环己基氨基磺酸钠标准品0.1000g（精确至0.0001g），用超纯水溶解并定容至100mL容量瓶中，配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液，置于4℃冰箱避光保存，有效期6个月。临用前，准确量取适量标准储备液，用初始流动相（乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液，体积比10:90）逐级稀释，配制成浓度分别为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、500.0ng/mL的系列标准工作溶液，现配现用。1.3样品前处理1.3.1液体样品（碳酸饮料、果汁饮料、冷冻饮品）取适量样品，超声脱气10min（冷冻饮品需先置于40℃水浴融化后混匀），准确称取2.0g（精确至0.001g）样品于50mL离心管中，加入10mL超纯水，涡旋振荡2min，加入5mL乙腈，涡旋3min，8000r/min冷冻离心5min，取全部上清液待净化。1.3.2固体/半固体样品（蜜饯、糕点、酱腌菜）将样品切碎后用均质机均质，准确称取2.0g（精确至0.001g）均质样品于50mL离心管中，加入20mL超纯水，涡旋振荡5min，超声提取20min，8000r/min冷冻离心10min，取上清液；残渣再用10mL超纯水重复提取1次，合并两次上清液，加入10mL乙腈，涡旋3min，8000r/min冷冻离心5min，取全部上清液待净化。1.3.3净化将上述待净化上清液全部通过预先活化的石墨化碳黑固相萃取小柱（活化过程：依次用5mL甲醇、5mL超纯水活化），待样品溶液全部流过之后，用5mL20%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱，用10mL5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，用初始流动相定容至1mL，涡旋混匀，过0.22μm有机相滤器，供液相色谱-串联质谱仪测定。1.4仪器条件1.4.1液相色谱条件色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；柱温：35℃；进样量：5μL；流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈；流速：0.3mL/min。梯度洗脱程序：0~2.0min，10%B；2.0~5.0min，10%B线性升至90%B；5.0~7.0min，90%B保持；7.1~10.0min，10%B平衡。1.4.2质谱条件电离模式：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；监测模式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：-3000V；离子传输管温度：325℃；蒸发温度：350℃；鞘气压力：35Arb；辅助气压力：10Arb；碰撞气为氩气，压力1.5mTorr。环己基氨基磺酸钠的质谱参数见表1：表1环己基氨基磺酸钠的MRM参数|化合物名称|母离子（m/z）|子离子（m/z）|碰撞能量（eV）|碰撞室输出电压（V）|备注||--------------------------|---------------|---------------|----------------|---------------------|--------||环己基氨基磺酸钠|178.1|80.0|18|70|定量离子||环己基氨基磺酸钠|178.1|96.0|12|70|定性离子|2.结果与讨论2.1色谱及质谱条件优化对比了不同类型色谱柱对环己基氨基磺酸钠的保留效果，包括C18柱、氨基柱、HILIC柱和HSST3柱。结果表明，环己基氨基磺酸钠属于强极性化合物，在普通C18柱上保留极弱，几乎无保留；氨基柱对其保留较强但峰形拖尾严重；HSST3柱对极性化合物具有良好的保留能力，且峰形对称，无拖尾，因此选择HSST3柱作为分析柱。流动相方面，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-乙酸铵水溶液、乙腈-甲酸水溶液体系的分离效果。结果显示，在流动相中加入5mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸可以显著改善峰形，提高离子化效率，目标物的响应值比纯乙腈-水体系提高约2.3倍。对比甲醇和乙腈作为有机相的效果，乙腈体系下目标物的保留时间更稳定，基质效应更低，因此选择乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相。质谱参数优化过程中，首先在负离子模式下对环己基氨基磺酸钠标准溶液进行全扫描，确定母离子为m/z178.1（对应[C6H12NO3S]-），然后对母离子进行子离子扫描，得到两个特征子离子m/z80.0（对应[SO3]-）和m/z96.0（对应[HSO4]-），选择响应最强的m/z178.1>80.0作为定量离子，178.1>96.0作为定性离子。进一步优化了碰撞能量、喷雾电压、离子传输管温度等参数，使得两个离子对的响应值达到最高，信噪比最优。2.2前处理方法优化针对不同基质的样品，优化了提取溶剂和净化方式。对比了水、甲醇、乙腈、20%甲醇水溶液作为提取溶剂的效果，结果表明水对甜蜜素的提取效率最高，对于固体样品，两次水提的回收率可达92%以上，显著高于有机溶剂提取。净化过程中对比了C18固相萃取柱、石墨化碳黑柱、HLB柱的净化效果，结果显示石墨化碳黑柱可以有效去除样品中的色素、有机酸等杂质，基质效应在85%~110%之间，无明显基质抑制或增强效应，而C18柱和HLB柱对色素的去除效果较差，基质抑制效应可达30%以上。因此选择石墨化碳黑固相萃取小柱作为净化柱，优化了淋洗液和洗脱液的组成，最终确定5mL20%甲醇水溶液淋洗去除弱极性杂质，10mL5%氨水甲醇溶液洗脱目标物，洗脱效率可达98%以上。2.3方法学验证2.3.1线性范围与检出限将1.2节配制的系列标准工作溶液按1.4节仪器条件进样分析，以定量离子对的峰面积（y）对标准溶液浓度（x，ng/mL）绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=1256.3x+321.5，相关系数R²=0.9998，表明在1.0~500.0ng/mL浓度范围内线性关系良好。以3倍信噪比（S/N=3）计算方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）计算定量限（LOQ），得到本方法的检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg，远低于GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定的甜蜜素最大使用限量（0.25~6.0g/kg），能够满足实际样品检测需求。2.3.2回收率与精密度选择阴性的碳酸饮料、蜜饯、酱腌菜3种典型基质样品，分别进行低、中、高3个水平的加标回收实验，加标浓度分别为1.0μg/kg、10.0μg/kg、100.0μg/kg，每个水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。表2不同基质中甜蜜素的加标回收率和精密度（n=6）|基质类型|加标水平（μg/kg）|平均回收率（%）|RSD（%）||----------|-------------------|-----------------|----------||碳酸饮料|1.0|92.3|3.2||碳酸饮料|10.0|95.6|2.1||碳酸饮料|100.0|97.2|1.8||蜜饯|1.0|88.5|4.5||蜜饯|10.0|91.7|2.8||蜜饯|100.0|94.3|2.2||酱腌菜|1.0|85.2|5.1||酱腌菜|10.0|89.4|3.4||酱腌菜|100.0|92.6|2.5|结果表明，3种基质中3个加标水平的平均回收率在85.2%~97.2%之间，相对标准偏差在1.8%~5.1%之间，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，说明本方法具有良好的准确度和精密度。2.3.3基质效应评价采用基质匹配标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率比值评价基质效应，比值在85%~115%之间说明无明显基质效应。实验结果显示，碳酸饮料基质的斜率比值为102.3%，果汁饮料为98.7%，蜜饯为91.5%，糕点为93.2%，酱腌菜为88.4%，冷冻饮品为97.6%，均在无明显基质效应范围内，说明本方法的前处理净化效果良好，可采用纯溶剂标准曲线进行定量，无需基质匹配校正，简化了实验流程。2.4实际样品检测应用本方法对采购的42份市售食品样品进行检测，结果显示，12份酱腌菜样品中有3份检出甜蜜素，含量分别为0.12g/kg、0.35g/kg、0.48g/kg，其中后两份超过GB2760-2014中酱腌菜类甜蜜素最大使用限量0.3g/kg的要求，不合格率为16.7%；8份蜜饯样品中有2份检出甜蜜素，含量分别为0.82g/kg、1.15g/kg，均符合蜜饯类最大使用限量1.0g/kg的要求（其中1.15g/kg的样品超标，不合格率12.5%）；10份饮料样品中有1份碳酸饮料检出甜蜜素，含量为0.08g/kg，符合碳酸饮料类最大使用限量0.65g/kg的要求；6份糕点样品和6份冷冻饮品样品均未检出甜蜜素。整体样品总合格率为88.1%，不合格样品主要集中在酱腌菜和蜜饯类别，提示监管部门需重点加强对这两类食品中甜蜜素添加的监督管理。2.5与国标方法的比较目前我国检测食品中甜蜜素的国标方法为GB5009.97-2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》，包括气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法。本方法与国标中的液相色谱-质谱/质谱法相比，前处理过程更加简化，通过优化固相萃取净化步骤，