CN119421930A 绿色可激发串联染料及其制备和使用方法 （贝克顿·迪金森公司）

2024.12.23PCT/US2023/0235132023.05.25WO2023/235219EN2023.12.07共轭聚合物骨架连接的一个或多个绿色可激发2其中所述供体荧光团和所述受体荧光团处于2.根据权利要求1所述的串联染料，其中一个或多个绿色可激发供体荧光团是基于二3.根据权利要求1_2中的任一项所述的串联染料，其中所述一个或多个绿色可激发供4.根据权利要求1_3中的任一项所述的串联染料，其中一个或5.根据权利要求1_4中的任一项所述的串联染料，其中一个或多个受体荧光团选自由6.根据权利要求1_5中的任一项所述的串联染料，其中供体荧光团的数量超过受体荧7.根据权利要求1_6中的任一项所述的串联染料，其中供体荧光团的数量范围为2至8.根据权利要求1_7中的任一项所述的串联染料，其中所述串联染料包含单个受体荧11.根据权利要求10所述的串联染料，其中所述特异性结合成员是抗体或者其结合片12.根据权利要求1_11中的任一项所述的串联染料，其中所述非共轭聚合物骨架包含(a)使所述样品与特异性结合所述靶标分析物的标记特异性结合成员接触以产生标记制备前体非共轭聚合物骨架，其包含分别具将绿色可激发供体荧光团缀合至所述前体非共轭聚合物骨架的任何第一反应性侧链，3其中所述供体荧光团和所述受体荧光团处于4[0005]一些应用(例如流式细胞术应用)采用不同荧光标记的特异性结合成员(例如抗多种不同的荧光染料用于同一样品，其中多种不同的荧光染料在激发和/或发射最大值方两个共价连接的不同荧光团的化合物，这些荧光团可以直接或通过连接基团彼此共价连物骨架连接的一个或多个受体荧光团；其中供体荧光团和受体荧光团处于能量转移关系。5[0011]图3显示了根据本发明实施方案的示例性BODIPY型供体聚合物串联染料的吸收与[0012]图4A和4B显示了根据本发明实施方案的示例性聚合物BODIPY型供体串联染料的[0013]图5A和5B显示了根据本发明实施方案的示例性聚合物罗丹明型供体串联染料的[0014]图6A至6G显示了根据本发明实施方案的示例性聚合物串联染料的吸收与发射光6性结合至分子对中另一个成员的特定空间和极性组织并因此与分子对中另一个成员的该合的强度，增加的结合亲和力与较低的KD相关。在一实施方案中，亲和力通过例如由如在25℃测量相互作用的结合动力学来确定的。7区”或“CDR”)中断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,”E.Kabatetal.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,(1991))。本文讨论的所有抗体氨基酸8性环境中例如在生理条件下良好溶剂化并且赋予其所附接的分子改善的水溶性的基团或体或受体荧光团)在主要水性溶液中的溶解度。水溶性基团可以是在水性环境中良好溶剂3M/3M/3+2CH2O)pR及以独立地为H或烷基(例如甲基)以及M/可以是阳离子反离子或氢、__ZZ1_C12烷氧基或(OCH2CH2)zOCH3取代，其中每个被至少一个WSG基团(例如，一个或两个WSG基团)取代的苄基，该WSG基团选自(CH2)x[0034]可以通过支化连接基将多个WSG包括在主题染料的单个位置处。在某些实施方案够赋予超过50mg/mL的水溶性的非离子侧链基团。在一些情况下，WSG是能够赋予超过9[0035]可用于WSG的感兴趣的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)基团或改性PEG基团。感“Poly(ethyleneglycol)Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications”,J.M.Harris,Ed.,PlenumPress,NewChemistryandBiologicalApplications”,J.M.HarrisandS.Zalipsky,Eds.,ACS 2兴趣的聚合物的其他实例包括具有式_[C(O)_X_C(O)_NH_Y_NH]n_或_[NH_Y_NH_C(O)_X_C(O)]n_的分子量大于1,000道尔顿的聚酰胺，其中X和Y是可以相同或不同并且可以是支化的或线性的二价基团，n是2_100如2至50的离散整数，其中X和Y之一或两者包含生物相容222通过酰胺键形成附接的氨基或羧酸基团)的水溶性聚合物。主题水溶性聚合物可以改性以些键仅作为示例提供，并不旨在限制本文公开的WSG中可用的水溶性聚合物的聚合物链或[0040]水溶性基团(WSG)可以能够赋予主题染料或聚合物串联染料超过10mg/mL的水溶(WSG)能够赋予主题染料或聚合物串联染料(例如，水性缓冲液)中20mg/mL或更大的水溶酰氧基和酰氨基末端基团和/或取代基。可适用于主题多发色团的PEG基团包括由S.Zalipsky在“Functionalizedpoly(ethyleneglycol)forpreparationof和由Zhu等人在“Water一SolubleConjugatedPolymersforImaging,Diagnosis,and去一个氢原子而衍生的饱和支化或直链单价烃基。感兴趣的烷基基团包括但不限于甲基；如1至4个碳原子。举例而言，该术语包括线性和支化烃基基团，诸如甲基(CH3一)、乙基(CH3CH2)、正丙基(CH3CH2CH2)、异丙基((CH3)2CH)、正丁基(CH3CH2CH2CH2)、异丁基3)2CHCH2叔丁基((CH3)3C)、正戊基(CH3C和新戊基((CH3)3CCH2)。2烷基2芳基2烷2取代的烷基、SO2芳基和SO2杂芳基。NRR，其中每个R独立地选自[0051]“芳基”本身或作为另一取代基的一部分是指通过从芳环系统的单个碳原子除去[0053]“杂芳基”本身或作为另一取代基的一部分是指通过从杂芳环系统的单个原子除桥环和螺环系统)并且具有3至20个环原子(包括1至10个杂原子)的饱和或不饱和基团。这2_烷基2_2CH2_2CH2CH2_60_60R616032232O_60606060和R61与它们所键取代的杂芳基，或任选地R64和R65与它们所键合的氮原子一起形成环杂烷基或取代的环杂OR6060_NR6032N32R602O_2R60(O_)2_60606060R61NO22R6060)_60OR60OR6060NO22R606060_R6061和R62如上定义。例如，取代的基团可以带有亚甲基H基团及其盐。[0069]除非另有说明，本文未明确定义的取代基的命名法是通过命名官能团的末端部物骨架连接的一个或多个受体荧光团；其中供体荧光团和受体荧光团处于能量转移关系。上下文另外明确指出，否则直至下限单位的十分之一)以及所陈述范围中的任何其他陈述出版物引用相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内以按照所叙述的事件的顺序或者以逻辑上可能的任何其他[0079]为了语法流畅性和功能性解释已经或将要描述该装置和方法，但是应当明确理[0080]在进一步描述本发明的各种实施方案时，首先更详细地综述绿色可激发串联染527nm至537nm的光的激光器激发。此类激光器的实例包括但不限于514nm的Ar+激光器、发供体荧光团是吸收绿色波长范围(例如从500nm至565nm，例如510至555nm、520nm至光团的最大吸收范围为500nm至565nm，例如510至555nm、520nm至545nm、525nm至540nm、[0089]在某些情况下，基于二吡咯亚甲基的染料是基于二吡咯亚和R42和R1以及R7和R1的任何一对或多对取基团(WSG)和T1J1的取代基取代；1Z1的取代基取代。炔基)(任选的连接基)(聚乙二醇基团)。例如，Y1或Y2基团可以是(亚炔基)CH2O4和R5中的至少一个选自以下结构：[0106]国际专利申请PCT/US2022/021137中描述了示例性的基于二吡咯亚甲基的绿色可NO234是35是1/2(硫酸根)的阴离831和二乙氨基香豆素。感兴趣的荧光染料包括但不限于：、CascadeBlue、Cascade铕螯合物、铽螯合物和钐螯合物。在一些实施方案中，聚合物串联染料包括与选自Cy5、581/591、BODIpye630/650、BODIpyg650/665、BODIpygR6G、TMR、合物。关于可用于本发明实施方案的聚合物骨架的更多细节，可见于PCT申请序列号PCT/US2019/024662(公开为WO2019/191482)和PCT申请序列号PCT/US2020/019510(公开为和一个或多个悬垂受体荧光团(它们被配置为靠近一个或多个悬垂供体荧光团以接收能体荧光团的取代基基团。在一些情况下，每个悬垂供体荧光团基团都被一个或多个WSG取中例如在生理条件下良好溶剂化并且赋予其所附接的分子改善的水溶性的基团或取代基。与缺乏WSG的对照染料相比，WSG可以增加给定聚合物串联染料在主要水性溶液中的溶解基团可适用于主题染料的WSG。任何方便的水溶性基团(WSG)均可包含在本文所述的染料的受体信号传导荧光团之间的能量转移机制包括例如共振能量转移(例如，Firster(或荧色团收集的能量的10％或更多(例如20％或更多或者30％或更多、40％或更多、50％或更体荧光团的信号是与用同等强度的入射光直接激发受体荧光团相比的1.5倍或更大。可以联染料的MW可以表示为平均分子量。在一些情况下，串联染料的平均分子量在500至500,[0161]在一些情况下，串联染料表现出的有效斯托克斯位移范围为25nm至300nm，例如托克斯位移为25nm或更大，如50nm或更大、75nm或更大、100nm或更大，如110nm或更大、至更高。在某些情况下，串联染料的发射的亮度比直接激发的受体荧光团的亮度高至少5[0175]第一重复单元(M1_S1)和第二重复单元(M2_S2)可以以随机或共嵌段配置排列。在开为WO2019/191482)中所述，其公开内容通过引用并入本文)等。在式(IIa)的某些情况2[0191]非共轭重复单元的聚合物骨架包含SM1和SM2共聚单体，它们各[0196]在式(IIIa)的某些实施方案中，SM1和SM2各自独立地为饱和非共在式(IIIa)的一些情况下，y为20mol％或更小，例如15mol％或更小、10mol％或更小、[0223]主题聚合物串联染料可以包括式(VIa)的多个段，其中每个段包括两侧是含D1共qq[0244]在式(IVa)、(Va)、(XIIIa)和(IXa)的一些情况下，x为80mol％或更大，例如些情况下，a为80mol％或更大，例如85mol％或更大、90mol％或更大、95mol％或更大、置的连接基可以被选择为与可存在于串联染料侧链的任何其他连接基(包括化学选择性标[0264]Z是化学选择性标签或特异性结合成员。有关可在本发明实施方案的串联染料中找到的WSG基团的更多详细信息，可见于PCT申请序列号PCT/US2019/024662(公开为WO样品在标记特异性结合成员特异性结合至靶标分析物(如果存在)的条件下与标记特异性30℃、35℃或37℃。可以选择用于特异性结合的任何方便的孵育时间以允许形成所需量的[0267]任何方便的特异性结合成员可以用于本发明方法中采用的标记特异性结合成员(CD34+)。任何方便的细胞表面蛋白或细胞标记物都可以靶向与在主题方法中所用的缀合子和合成分子，其可以使用任何方便的重组表达方法或使用任何方便的合成方法来制备，以靶向特异性结合感兴趣的抗体或抗体片段的任何方便的靶标分[0271]标记特异性结合成员可用于主题方法中，例如用聚合物串联荧光染料标记靶细员靶标分析物结合复合物是标记特异性结合成员与靶标分析物(或针对靶标抗原的主要[0276]分离还可以包括一个或多个任选的洗涤步骤以从支持物去除样品的未结合材统。可以利用对荧光材料进行测定的多种方法，如Lakowicz，J.R.，PrinciplesofFluorescentSpectroscopy,NewYork:PlenumPress(1983)；Herman,B.,Resonanceenergytransfermicroscopy,in:FluorescenceMicroscopyofLivingCellsinDiego:AcademicPress(1989),pp.219_243；Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistry,MenloPark:Benjamin/CummingsPublishingCol,Inc.(1978),pp.29异性结合成员。用于标记靶标的感兴趣的方法包括但不限于由Hermanson,Bioconjugate炔基团)官能团并且靶标分子包括叠氮官能团，或反之亦然，其可以通过点击化学进行缀(例如过量的试剂或未标记的特异性结合成员)分离。可以利用多种方法从样品分离靶标，方法和组合物来检测和/或分析特异性结合成员。可用于主题方法的分析感兴趣靶标的方或信号输出定量领域中已知的那些分子。超过一种的特异性和/或非特异性抗体可以被标以包括样品视场或装有样品和本发明的标记特异性结合成员的流动通道，例如如上所述。或多个额外信号的一个或多个额外检测器和对应站点处的每个处理器通信的合适的读取器[0292]在某些方面，系统包含流式细胞仪。合适的流式细胞术系统可包括但不限于Ormerod(ed.),FlowCytometry:APracticalApproach,OxfordUniv.Press(1997)；Jaroszeski等人(eds.),FlowCytometryProtocols,MethodsinMolecularBiologyBiosciencesFACSCantoTM流式细胞仪、BDBiosciencesFACSCantoTMII流式细胞仪、BD式细胞仪、BDBiosciencesFACSViaTM流式细胞仪和BDBiosciencesFACSCaliburTM细胞仪、BDBiosciencesViaTM细胞分选仪、BDBiosciencesInfluxTM细胞分选仪、BDBiosciencesJazzTM细胞分选仪、BDBiosciencesAriaTM细胞分选仪、BDBiosciencesFACSAriaTMII细胞分选仪、BDBiosciencesFACSAriaTMIII细胞分选仪、BDBiosciencesFACSAriaTMFusion细胞分选仪和BDBiosciencesFACSMelodyTM细胞分选仪、BDBiosciencesFACSymp10,620,111和美国专利公开号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/[0298]在某些实施方案中，试剂盒用于评估样品中靶标分析物(诸如细胞内靶标)的存[0304]如本文所述的绿色可激发串联染料和包含该染料的标记特异性结合成员、组合文描述的组合物、系统和方法可用于其中使激发串联染料可被具有例如532nm的波长的绿[0305]在一些情况下，方法和组合物用于其中有兴趣对来自样品的靶标进行检测和/或[0309]有关合成具有绿色可激发供体荧光团的串联染料的一些不同方法的总结可见于1976和Meienhofer,“HormonalProteinsandPeptides”,Vol.2,p.46,AcademicPress(NewYork),1983中；以及Kent,Ann.Rev.Biochem.,57,957,1988中的固相肽合成和此类合成方法的方便的保护基描述于上述参考文献以及McOmic“ProtectiveGroupsinOrganicChemistry”,PlenumPress,NewYork,1973和GreeneandWuts,“Protective(具有提供750nm发射的受体)、Tandem780(DMX1)(具有提供780nm发射的受体)和TandemCy5.5[0316]图1显示了串联染料DMX_1至DMX_6的UV_可见光吸收光谱。每个串联染料具有约[0318]将少量聚合物串联染料在1xPBS中的储备溶液在总体积2mL的1xPBS中稀释至信号转换为校正的荧光(S1c)和校正噪声(R1c)。然后根据校正的噪声对校正的荧光S1c进[0319]图2显示了聚合物串联染料DMX_1至DMX_6在被532nm的绿色激光激发时的归一化[0320]图3显示了DMX_1至DMX_6样品的归一化吸收(即激发)光谱及其相应的归一化发射和受体的串联染料的结果：具有绿光吸收的BODIPY型供体和具有各种不同发射光谱的受[0331]4.根据条目1_3中的任一项所述的[0332]5.根据条目1_4中的任一项所述的串[0333]6.根据条目5所述的串联染料，其中所述基于二吡咯亚甲基_硼的荧光团具有式和R42和R1以及R7和R1的任何一对或多对取1_Z1的取代基取代。[0342]7.根据条目1_6中的任一项所述[0343]8.根据条目7所述的串联染料，其中一个或多个[0349]9.根据条目7_8中的任一项所述的串联[0350]10.根据条目9所述的串联染料，其中一个或多个基于荧光素的荧光团具有式[0357]11.根据条目7_10中的任一项所述[0358]12.根据条目11所述的串联染料，其中一个或多个基于罗丹明的荧光团具有式__[0366]13.根据条目1_12中的任一项所述[0368]15.根据条目14所述的串联染料，其中[0370]17.根据条目1_16中的任一项所[0371]18.根据条目1_17中的任一[0372]19.根据条目1_18中的任一项所述[0374]21.根据条目1_20中的任一[0375]22.根据条目1_21中的任一项所述的[0378]25.根据条目24所述的串联染料，其[0379]26.根据条目1_25中的任一项所[0380]27.根据条目1_26中的任一项所[0383](a)使所述样品与特异性结合所述靶标分析物的标记特异性结合成员接触以产生[0388](b)测定所标记的组合物中标记特异性结合成员_靶标分和R42和R1以及R7和R1的任何一对或多对取1_Z1的取代基取代。[0403]36.根据条目35所述的方法，其中一个或多个[0418]40.根据条目39所述的方法，其中一个或多__[0430]45.根据条目29_44中的任一项所述的方[0437]52.根据条目50_51中的任一项所述的方法，其中所述生物分子是特异性结合成[0438]53.根据条目52所述的方法，其中所述[0446]61.根据条目60所述的方法，[0452]将绿色可激发供体荧光团缀合至所述前体非共轭聚合物骨架的任何第一反应性分子缀合至所述前体非共轭聚合物骨架的任和R42和R1以及R7和R1的任何一对或多对取1_Z1的取代基取代。[0468]72.根据条目71所述的方法，其中一个或多个基