副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱构建及D15免疫原性深度解析

副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱构建及D15免疫原性深度解析一、引言1.1研究背景副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，Hps），作为巴斯德菌科嗜血杆菌属的一员，是一种对全球养猪业造成严重危害的细菌，主要感染猪，能引发猪的多发性浆膜炎、肺炎、关节炎和脑膜脑炎等，这些病症合称为格拉泽氏病（Glasser'sdisease）。该菌为革兰氏阴性小杆菌，无鞭毛，不具备运动性，可形成荚膜和菌毛，并且生长依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。副猪嗜血杆菌病在养猪业中危害极大。在流行病学方面，其传染源主要是带菌猪和病猪，传播途径涵盖空气传播、猪只直接接触传播以及通过污染的排泄物传播。所有阶段的猪都有感染风险，但1-2月龄的断奶仔猪或保育阶段的猪更为易感。发病率通常在10%-15%，严重时死亡率可高达50%。而且，副猪嗜血杆菌作为条件性致病菌，常与其他病毒或细菌混合感染，如与猪繁殖与呼吸综合征病毒（蓝耳病）、猪圆环病毒、猪肺炎支原体等混合感染，这使得猪群的病情更为复杂，治疗和防控难度大幅增加，给养猪业带来了沉重的打击。患病猪只的临床表现多样，急性感染的猪只会突然发病，体温飙升至40.5℃-42.0℃，采食量锐减，精神萎靡，反应迟钝，关节肿胀，跛行，步态僵硬，喜欢侧卧，耳部发紫，全身皮肤发红或苍白，眼结膜发绀，上下眼睑皮下水肿，呼吸困难，呈现腹式呼吸，短促咳嗽，疼痛尖叫，鼻孔有黏液性及浆液性分泌物，病情严重时会死亡，死前侧卧，抽搐或四肢呈划水样。若治疗不及时或不当，急性感染可能转化为慢性感染。慢性感染常见于保育猪，主要表现为反复发烧，体温在39℃-40℃，食欲不振，皮肤苍白，耳朵、颈部、腹下、四肢末梢有紫色斑块，咳嗽，腹式呼吸，眼睑浮肿，有些病猪耳根发凉，生长缓慢，消瘦，被毛粗乱，关节肿胀、疼痛，行走步态僵硬，跛行甚至呈犬坐样姿势，严重时肌肉震颤，2-3天后死亡，也可能突然死亡。在当前养猪业中，副猪嗜血杆菌病不仅直接导致猪只的死亡和淘汰，增加养殖成本，还严重影响猪只的生长性能，使猪只生长速度减缓，饲料转化率降低，进而降低养殖的经济效益。同时，治疗疾病所需的药物费用、兽医服务费用以及因疫情防控而增加的消毒、隔离等措施的成本也不容忽视，疫情的发生还可能导致养殖场的声誉受损，影响猪肉产品的销售，进一步加剧经济损失。目前，预防和控制副猪嗜血杆菌感染主要依靠疫苗。然而，由于副猪嗜血杆菌具有多种血清型，不同血清型之间的交叉保护力较弱，现有的疫苗难以提供全面有效的保护。外膜蛋白作为细菌细胞表面的重要组成部分，在细菌与宿主的相互作用中发挥着关键作用，其不仅参与细菌的物质运输、信号传递等生理过程，还具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答。因此，建立副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱，并对其免疫原性进行鉴定，有助于深入了解该菌的致病机制和免疫原性，筛选出具有良好免疫原性的蛋白作为疫苗候选分子，为开发高效、广谱的副猪嗜血杆菌疫苗提供理论依据和技术支持，对于防控副猪嗜血杆菌病、保障养猪业的健康发展具有重要意义。1.2国内外研究现状在副猪嗜血杆菌的研究领域，国内外学者围绕外膜蛋白和D15免疫原性展开了诸多探索。国外研究起步较早，在副猪嗜血杆菌外膜蛋白研究方面取得了一定成果。在分离鉴定技术上，不断改进方法以获取高纯度外膜蛋白，如采用差速离心结合密度梯度离心等技术，能更有效地分离外膜蛋白，减少其他杂质蛋白的干扰。通过这些技术，明确了副猪嗜血杆菌外膜蛋白包含多种成分，如OmpA、OmpB、OmpC等，这些蛋白在细菌的物质运输、信号传递以及与宿主细胞的相互作用中发挥着关键作用。在免疫原性研究上，利用基因工程技术构建外膜蛋白表达载体，在大肠杆菌等表达系统中表达重组外膜蛋白，通过动物实验评估其免疫原性，为疫苗研发奠定基础。部分研究发现某些外膜蛋白能诱导机体产生较强的免疫应答，产生特异性抗体，在一定程度上保护动物免受副猪嗜血杆菌的感染。但外膜蛋白的研究仍存在不足，外膜蛋白的提取和纯化过程复杂，成本较高，且不同菌株的外膜蛋白组成和结构存在差异，给研究带来了挑战。不同血清型副猪嗜血杆菌外膜蛋白的免疫原性差异较大，难以找到一种通用的免疫原用于疫苗开发。国内研究也在逐步深入。在流行病学调查方面，对不同地区副猪嗜血杆菌的感染情况、血清型分布进行了大量研究，明确了我国部分地区的主要流行血清型，为疫苗的选择和防控策略的制定提供了依据。在副猪嗜血杆菌外膜蛋白研究上，除了借鉴国外的先进技术，还结合国内实际情况进行创新。有研究利用二维凝胶电泳（2-DE）技术结合质谱分析，建立了副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱，通过图谱分析筛选出差异表达的外膜蛋白，进一步研究其功能和免疫原性。对D15免疫原性的鉴定，国内也开展了相关研究，通过免疫动物制备抗血清，采用免疫血清学方法如ELISA、Westernblot等检测抗血清与D15外膜蛋白的反应性，评估其免疫原性。但国内研究同样面临一些问题，对于外膜蛋白与宿主免疫系统相互作用的分子机制研究不够深入，限制了对副猪嗜血杆菌致病机制的全面理解。在D15免疫原性鉴定方面，缺乏标准化的鉴定方法和评价指标，不同研究结果之间的可比性较差。国内外在副猪嗜血杆菌外膜蛋白及D15免疫原性研究上虽取得了一定进展，但仍存在诸多不足，在方法技术、机制探究以及标准化等方面有待进一步完善和深入研究。1.3研究目的和意义本研究旨在建立副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱，深入解析其外膜蛋白组成，并对D15菌株的免疫原性进行全面鉴定，以筛选出具有潜在应用价值的免疫原性蛋白，为副猪嗜血杆菌疫苗的研发提供坚实的理论基础和关键的技术支持。从学术研究角度来看，建立副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱能够更全面地揭示该菌的蛋白质组学特征，有助于深入探究其致病机制和免疫原性机制。外膜蛋白在细菌与宿主细胞的相互作用中发挥着核心作用，通过对其组成和结构的研究，可以了解细菌如何突破宿主的免疫防线、引发感染以及逃避宿主免疫监视的分子机制，为进一步研究副猪嗜血杆菌的生物学特性提供重要线索。对D15免疫原性的鉴定，能够明确该菌株外膜蛋白的免疫活性，为免疫机制的研究提供数据支撑，丰富了细菌免疫原性研究的内容，推动相关学科理论的发展。在实际应用层面，副猪嗜血杆菌病对养猪业造成了巨大的经济损失。目前疫苗是防控该病的主要手段，但由于血清型众多且交叉保护力弱，现有疫苗效果不佳。本研究通过建立外膜蛋白图谱和鉴定D15免疫原性，有望筛选出具有广谱免疫原性的蛋白，为开发新型、高效、广谱的副猪嗜血杆菌疫苗奠定基础。新型疫苗的研发成功，将有效提高猪群对副猪嗜血杆菌的抵抗力，降低发病率和死亡率，减少药物使用，提高养殖效益，保障养猪业的健康可持续发展。还能减少因疾病导致的猪肉品质下降和产量减少，稳定猪肉市场供应，对保障食品安全和促进农业经济发展具有重要意义。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株、培养基及质粒副猪嗜血杆菌菌株选用具有代表性的SH0165菌株，该菌株分离自临床发病猪，在副猪嗜血杆菌相关研究中被广泛应用，其生物学特性和致病机制相对明确，有助于实验结果的分析和比较。将其保存于-80℃冰箱，使用时从甘油冻存管中取出，接种于含有10%小牛血清和10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，于37℃、5%CO₂培养箱中复苏培养18-24h，观察菌株生长情况。培养基采用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基和TSB培养基，TSA培养基用于菌株的固体培养，TSB培养基用于菌株的液体培养。在TSA培养基中添加1.5%的琼脂粉，使其凝固成固体状态，便于菌株的分离和纯化；在TSB培养基中添加10%小牛血清和10μg/mLNAD，为菌株的生长提供必要的营养成分。在超净工作台中，将TSA培养基和TSB培养基分别分装于无菌培养皿和三角瓶中，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、103.4kPa条件下灭菌15-20min，待冷却至适宜温度后使用。质粒选用pET-32a(+)表达载体，该载体具有氨苄青霉素抗性基因，在大肠杆菌中能够稳定复制和表达外源基因。其多克隆位点丰富，便于目的基因的插入和表达调控，在基因工程实验中应用广泛。从保存质粒的甘油菌中吸取少量菌液，接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min振荡培养过夜，提取质粒备用。采用碱裂解法提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测质粒的纯度和浓度，确保质粒质量符合实验要求。2.1.2主要实验仪器实验中用到的关键仪器设备众多。高速冷冻离心机（如德国Eppendorf公司的5424R型离心机），主要用于细菌菌体的收集、外膜蛋白的分离以及蛋白样品的离心浓缩等操作。在收集细菌菌体时，将培养后的菌液转移至离心管中，设置离心机转速为8000r/min，离心时间为10min，温度为4℃，可有效沉淀细菌菌体。其最大转速可达16000r/min，离心力强大，能够满足不同实验需求，且温度控制精准，可防止样品在离心过程中因温度升高而变性。恒温培养箱（如上海一恒科学仪器有限公司的DHG-9240A型恒温培养箱），用于副猪嗜血杆菌的培养，为菌株生长提供稳定的温度和湿度环境。将接种有副猪嗜血杆菌的培养基置于培养箱中，设置温度为37℃，湿度为50%-60%，可促进菌株的良好生长。该培养箱温度均匀性好，波动范围在±0.5℃以内，能够确保培养条件的一致性。核酸蛋白测定仪（如美国ThermoFisherScientific公司的Nanodrop2000c型核酸蛋白测定仪），用于检测DNA、RNA和蛋白质的浓度和纯度。在提取质粒或外膜蛋白后，使用该仪器测定其浓度和纯度，为后续实验提供准确的数据支持。其操作简便，只需微量样品即可快速得出结果，且检测精度高，可同时检测多个样品。电泳仪（如北京六一生物科技有限公司的DYY-6C型电泳仪）和垂直电泳槽（如北京六一生物科技有限公司的DYCZ-24DN型垂直电泳槽），用于蛋白质和核酸的电泳分离。在进行蛋白质双向电泳时，先将等电聚焦后的胶条转移至垂直电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液，设置电泳参数进行电泳分离。该电泳仪具有稳定的电压和电流输出，可满足不同电泳实验的需求，垂直电泳槽则具有良好的密封性和散热性能，可保证电泳结果的准确性。此外，还有超净工作台、移液器、旋涡振荡器、水浴锅等仪器设备，在实验的各个环节发挥着重要作用。超净工作台用于提供无菌操作环境，移液器用于精确量取各种试剂和样品，旋涡振荡器用于混合溶液，水浴锅用于控制反应温度。2.1.3主要化学试剂实验所需的各类化学试剂包括多种。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）等，这些试剂是制备聚丙烯酰胺凝胶的主要原料，用于蛋白质电泳分离。在制备分离胶时，按照一定比例混合丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、APS和TEMED等试剂，迅速搅拌均匀后倒入垂直电泳槽的玻璃夹层中，待凝胶凝固后即可用于电泳实验。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCl）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）等，用于配制各种缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，这些缓冲液在实验中维持溶液的酸碱度稳定，确保实验环境的适宜性。在配制Tris-HCl缓冲液时，根据所需pH值，准确称取一定量的Tris和HCl，用去离子水溶解并定容至所需体积，使用pH计精确调节pH值。考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰醋酸等，用于蛋白质的染色和脱色，以便在电泳后观察蛋白质条带。将电泳后的凝胶浸泡在考马斯亮蓝R-250染色液中，染色一段时间后，用甲醇和冰醋酸的混合溶液进行脱色，直至蛋白质条带清晰可见。胰蛋白酶、尿素、硫脲、CHAPS等，用于蛋白质的酶解和溶解，在蛋白质鉴定和分析实验中发挥关键作用。在进行蛋白质酶解时，将蛋白质样品与适量的胰蛋白酶混合，在适宜的温度和pH条件下反应，使蛋白质分解为多肽片段，便于后续的质谱分析。所有化学试剂均为分析纯或以上级别，购自正规试剂供应商，确保试剂的质量和纯度符合实验要求。在使用前，仔细检查试剂的外观、保质期等信息，确保试剂无变质、无污染等问题。2.1.4主要溶液配方实验中使用的溶液配方有多种。SDS-PAGE电泳缓冲液（pH8.3）：称取30.3gTris、144g甘氨酸、10gSDS，用去离子水溶解并定容至1000mL。该缓冲液在SDS-PAGE电泳中，为蛋白质的迁移提供稳定的离子环境，使蛋白质在电场作用下能够按照分子量大小进行分离。在配制过程中，需充分搅拌，确保各试剂完全溶解，使用前用pH计检测并校准pH值。样品缓冲液（5×）：0.25mol/LTris-HCl（pH6.8）、10%（W/V）SDS、0.5%（W/V）溴酚蓝、50%（V/V）甘油、5%（V/V）β-巯基乙醇。在蛋白质样品处理时，将适量的样品缓冲液与蛋白质样品混合，β-巯基乙醇可还原蛋白质中的二硫键，使蛋白质充分变性，便于在电泳中分离。根据实验所需样品量，按照比例准确吸取各成分，现用现配，避免β-巯基乙醇被氧化而失去活性。等电聚焦缓冲液（pH3-10）：8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%（W/V）CHAPS、0.5%（V/V）IPG缓冲液（pH3-10）、100mmol/LDTT。用于等电聚焦电泳，使蛋白质在pH梯度中根据其等电点进行分离。在配制时，依次加入各成分，搅拌溶解，确保尿素和硫脲完全溶解，避免出现沉淀影响实验效果。固定液：50%（V/V）甲醇、10%（V/V）冰醋酸。在蛋白质染色前，将电泳后的凝胶浸泡在固定液中，可使蛋白质固定在凝胶中，防止在后续染色和脱色过程中蛋白质条带扩散。按照体积比准确量取甲醇和冰醋酸，混合均匀后即可使用。染色液：0.1%（W/V）考马斯亮蓝R-250、45%（V/V）甲醇、10%（V/V）冰醋酸。用于蛋白质的染色，使蛋白质条带在凝胶上呈现蓝色，便于观察和分析。将考马斯亮蓝R-250加入甲醇和冰醋酸的混合溶液中，充分搅拌溶解，过滤去除不溶性杂质后使用。脱色液：25%（V/V）甲醇、8%（V/V）冰醋酸。在蛋白质染色后，用于去除凝胶上多余的染色剂，使蛋白质条带更加清晰。按照比例配制脱色液，将染色后的凝胶浸泡在脱色液中，定期更换脱色液，直至背景清晰，蛋白质条带明显。2.2实验方法2.2.1SH0165菌株的培养条件将保存于-80℃冰箱的副猪嗜血杆菌SH0165菌株甘油冻存管取出，迅速置于37℃水浴锅中进行解冻，待冻存液完全融化后，在超净工作台中，用无菌移液器吸取100μL菌液，接种于装有5mL含有10%小牛血清和10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基的试管中。将试管放入恒温摇床中，设置温度为37℃，转速为200r/min，振荡培养18-24h。每隔3-4h观察一次菌株生长情况，通过检测菌液的OD600值来判断菌株的生长状态，当OD600值达到0.6-0.8时，表明菌株处于对数生长期，可用于后续实验。2.2.2外膜蛋白样品的制备取对数生长期的SH0165菌株菌液50mL，转移至50mL离心管中，在高速冷冻离心机中，设置转速为8000r/min，温度为4℃，离心10min，收集细菌菌体。弃去上清液，用预冷的PBS缓冲液（pH7.4）重悬菌体，再次离心，重复洗涤3次，以去除培养基中的杂质。向洗涤后的菌体沉淀中加入适量的细胞裂解液（含有50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF），充分悬浮菌体，冰浴30min，期间每隔5min振荡一次，使细胞充分裂解。将裂解后的样品在高速冷冻离心机中，设置转速为12000r/min，温度为4℃，离心30min，取上清液，即为粗提的外膜蛋白溶液。将粗提的外膜蛋白溶液通过0.22μm的滤膜进行过滤，去除未裂解的细胞碎片和其他杂质。采用超速离心法进一步纯化外膜蛋白，将过滤后的溶液转移至超速离心管中，在超速离心机中，设置转速为100000r/min，温度为4℃，离心2h，收集沉淀，即为纯化的外膜蛋白。用适量的PBS缓冲液重悬外膜蛋白沉淀，分装后保存于-80℃冰箱备用。2.2.3蛋白定量采用Bradford法进行蛋白定量。该方法的原理是考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）残基结合，形成蓝色复合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在595nm波长处有最大吸收峰，通过测定吸光度值，可根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。取96孔酶标板，分别加入不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品（0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL）各20μL，每个浓度设置3个复孔。向各孔中加入200μL考马斯亮蓝G-250染色液，轻轻振荡混匀，室温静置5min。使用酶标仪在595nm波长处测定各孔的吸光度值（OD595），以BSA浓度为横坐标，OD595值为纵坐标，绘制标准曲线。取适量的外膜蛋白样品20μL，加入到新的酶标孔中，按照上述步骤加入染色液并测定OD595值，根据标准曲线计算出外膜蛋白样品的浓度。2.2.4双向电泳（2D）双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到二维分布的蛋白质图。在进行双向电泳前，先进行样品制备。取适量的外膜蛋白样品，加入等体积的2×样品缓冲液（含8M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、0.5%IPG缓冲液（pH3-10）、100mMDTT），充分混匀，使蛋白质完全溶解，冰浴30min。将样品在10000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液用于等电聚焦电泳。第一向等电聚焦电泳：将IPG胶条（pH3-10，18cm）从冰箱中取出，平衡至室温后，放入胶条槽中，加入适量的重泡胀液（含8M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、0.5%IPG缓冲液（pH3-10）、10mMDTT），使胶条完全浸没。用移液枪吸取处理好的外膜蛋白样品400μg，缓慢加入到重泡胀液中，避免产生气泡。盖上胶条槽盖子，在10℃条件下重泡胀12-16h，使样品充分进入胶条。重泡胀结束后，将胶条转移至等电聚焦仪的聚焦槽中，设置等电聚焦程序：200V，1h；500V，1h；1000V，1h；8000V，4h；8000V，至总聚焦电压达到60000Vh。聚焦结束后，将胶条取出，放入平衡液I（含50mMTris-HCl，pH8.8，6M尿素、30%甘油、2%SDS、100mMDTT）中，室温振荡平衡15min。然后将胶条转移至平衡液II（含50mMTris-HCl，pH8.8，6M尿素、30%甘油、2%SDS、250mM碘乙酰胺）中，室温振荡平衡15min。第二向SDS-PAGE电泳：将平衡后的胶条转移至12%的SDS-PAGE凝胶的上样孔中，用0.5%的低熔点琼脂糖封胶。将凝胶放入垂直电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液（含25mMTris、192mM甘氨酸、0.1%SDS），在10mA/胶的电流下电泳30min，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电流调至20mA/胶，继续电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。2.2.5凝胶染色（银染）凝胶银染是一种高灵敏度的蛋白质染色方法，其原理是银离子（Ag+）在碱性条件下与蛋白质结合，然后通过还原剂（如甲醛）将Ag+还原成金属银，使蛋白质条带呈现黑色或棕色，从而实现蛋白质的可视化。电泳结束后，小心取出凝胶，放入固定液（含50%甲醇、10%冰醋酸）中，室温振荡固定1h，使蛋白质固定在凝胶中，防止在后续染色过程中蛋白质条带扩散。固定结束后，将凝胶转移至敏化液（含0.02%硫代硫酸钠）中，室温振荡敏化1min，增强凝胶对银离子的吸附能力。敏化后，用去离子水冲洗凝胶3次，每次5min，去除多余的敏化液。将凝胶放入染色液（含0.1%硝酸银、0.05%甲醛）中，室温振荡染色20min，使银离子与蛋白质结合。染色结束后，用去离子水快速冲洗凝胶2次，每次5s，去除表面多余的染色液。将凝胶转移至显色液（含3%碳酸钠、0.05%甲醛）中，室温振荡显色，直至蛋白质条带清晰可见。当条带达到合适的清晰度时，加入终止液（含5%冰醋酸），终止显色反应。用去离子水冲洗凝胶3次，每次10min，然后将凝胶保存于去离子水中，用于后续的图像分析。2.2.6图像分析及酶解使用凝胶成像系统对银染后的凝胶进行扫描，获取凝胶图像，采用ImageMaster2DPlatinum软件对图像进行分析。在软件中，首先对凝胶图像进行背景扣除，去除背景噪音的干扰，提高图像的清晰度。然后进行斑点检测，软件会自动识别凝胶上的蛋白质斑点，并对斑点的位置、面积、光密度等参数进行测量和分析。通过对比不同样品的凝胶图像，筛选出差异表达的蛋白质斑点，将其标记并编号。从凝胶上切下标记的蛋白质斑点，放入1.5mL离心管中。用去离子水冲洗斑点3次，每次15min，去除残留的染色液。加入适量的脱色液（含50%乙腈、25mM碳酸氢铵），室温振荡脱色，直至凝胶斑点变为无色。弃去脱色液，加入适量的胰蛋白酶溶液（25ng/μL，溶于25mM碳酸氢铵中），4℃放置30min，使胰蛋白酶充分浸润凝胶斑点。将离心管置于37℃恒温摇床中，振荡酶解12-16h，使蛋白质被胰蛋白酶水解成多肽片段。酶解结束后，加入5μL5%的三氟乙酸（TFA）终止酶解反应。2.2.7MALDI-TOF-MS分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是一种常用的蛋白质鉴定技术，其原理是将酶解后的多肽片段与基质混合，在激光的作用下，基质吸收能量蒸发，同时将多肽片段离子化并使其进入飞行时间质量分析器。在飞行时间质量分析器中，离子按照质荷比（m/z）的大小进行分离，通过测量离子的飞行时间，计算出多肽片段的质荷比，进而获得多肽指纹图谱。将所得的多肽指纹图谱与蛋白质数据库中的已知数据进行比对，根据匹配结果鉴定蛋白质的种类。取1μL酶解后的多肽样品，与1μL基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸，溶于50%乙腈、0.1%TFA中）混合均匀，点样于MALDI靶板上，室温干燥。将靶板放入MALDI-TOF-MS质谱仪中，设置合适的参数，如激光能量、离子源电压等，进行质谱分析。采集质谱数据，得到多肽指纹图谱。使用Mascot软件将所得的多肽指纹图谱与NCBI数据库中副猪嗜血杆菌的蛋白质序列进行比对，设定匹配的显著性阈值（如p<0.05），根据匹配结果确定蛋白质的名称、登录号、氨基酸序列等信息。2.2.8WESTERN-BLOTWesternBlot实验是一种常用的蛋白质检测技术，其目的是检测样品中特定蛋白质的表达情况，并分析其免疫原性。将双向电泳后的凝胶进行电转印，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在电转印前，先将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后将PVDF膜放入转印缓冲液（含25mMTris、192mM甘氨酸、20%甲醇、0.1%SDS）中平衡15min。将凝胶和PVDF膜按照“三明治”结构组装在转印夹中，注意凝胶和PVDF膜之间不能有气泡。将转印夹放入电转仪中，加入适量的转印缓冲液，在100V恒压条件下转印1-2h，使蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。转印结束后，将PVDF膜取出，放入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）中，室温振荡封闭1-2h，封闭非特异性结合位点。封闭结束后，将PVDF膜放入一抗溶液（兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体，用封闭液稀释至合适浓度）中，4℃孵育过夜，使一抗与PVDF膜上的目的蛋白质特异性结合。第二天，将PVDF膜取出，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，去除未结合的一抗。然后将PVDF膜放入二抗溶液（HRP标记的羊抗兔IgG抗体，用封闭液稀释至合适浓度）中，室温振荡孵育1-2h，使二抗与一抗特异性结合。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min，去除未结合的二抗。最后，向PVDF膜上滴加适量的化学发光底物（如ECL试剂），在暗室中曝光，使用凝胶成像系统检测发光信号，观察目的蛋白质条带的位置和强度。2.2.9蛋白克隆表达及纯化根据已鉴定的D15蛋白基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，在上游引物和下游引物的5'端分别引入合适的限制性内切酶位点（如BamHI和HindIII）。引物序列为：上游引物5'-CGGGATCCATG[基因起始序列]-3'，下游引物5'-CCCAAGCTT[基因终止序列]-3'。以副猪嗜血杆菌SH0165菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）包括：2×PCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O22μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的条带的大小和亮度。将PCR扩增得到的目的基因片段和pET-32a(+)表达载体分别用BamHI和HindIII进行双酶切。酶切反应体系（20μL）包括：10×Buffer2μL，BamHI和HindIII各1μL，目的基因片段或表达载体10μL，ddH₂O6μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收酶切后的目的基因片段和表达载体。将回收的目的基因片段和表达载体按照摩尔比3:1的比例混合，加入T4DNA连接酶和10×T4DNA连接酶Buffer，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。在超净工作台中，取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。然后将离心管放入42℃水浴锅中热激90s，迅速取出后冰浴2min。加入900μLLB液体培养基，37℃、220r/min振荡培养1h。将培养后的菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。第二天，从平板上挑取单菌落，接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养至OD600值达到0.6-0.8。加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目的蛋白表达，继续振荡培养4-6h。诱导结束后，将菌液转移至离心管中，8000r/min、4℃离心10min，收集菌体。弃去上清液，用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，再次离心，重复洗涤3次。向菌体沉淀中加入适量的细胞裂解液（含有50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF），充分悬浮菌体，冰浴30min，期间每隔5min振荡一次，使细胞充分裂解。将裂解后的样品在高速冷冻离心机中，设置转速为12000r/min，温度为4℃，离心30min，取上清液，即为粗提的重组蛋白溶液。采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。将粗提的重组蛋白溶液缓慢加入到预先平衡好的镍柱中，使重组蛋白与镍柱上的镍离子特异性结合。用含有不同浓度咪唑的PBS缓冲液（如20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑）进行梯度洗脱，收集洗脱液。对洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，确定目的蛋白所在的洗脱峰。将含有目的蛋白的洗脱液进行透析，去除咪唑等杂质，得到纯化的重组D15蛋白。三、副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱的建立3.1双向电泳结果经过双向电泳及银染处理后，获得了清晰的副猪嗜血杆菌外膜蛋白2-DE凝胶图谱（图1）。在pH3-10的线性梯度范围内，等电聚焦有效地将外膜蛋白按照等电点进行分离，随后的SDS-PAGE在12%的凝胶上进一步按照分子大小对蛋白进行分离，使得不同等电点和分子量的蛋白在二维平面上得以区分。从图谱中可以观察到，蛋白斑点在凝胶上呈现出较为均匀的分布，覆盖了不同等电点和分子量范围。在低分子量区域（小于30kDa），检测到多个蛋白斑点，这些蛋白可能参与细菌的基础代谢、信号传导等生理过程。在中等分子量区域（30-60kDa），蛋白斑点的数量较多且分布密集，表明该区域存在多种具有重要功能的外膜蛋白，如一些与物质运输、能量代谢相关的蛋白。在高分子量区域（大于60kDa），也能清晰地看到部分蛋白斑点，这些蛋白可能在细菌的结构组成、与宿主细胞的相互作用中发挥关键作用。对图谱进行初步分析，共检测到约[X]个蛋白斑点，其中部分蛋白斑点的表达量较高，颜色较深，表明这些蛋白在副猪嗜血杆菌外膜中含量丰富；而部分蛋白斑点的表达量较低，颜色较浅，可能是一些低丰度的外膜蛋白，但其在细菌的生理功能和致病机制中仍可能具有重要意义。通过ImageMaster2DPlatinum软件对凝胶图像进行分析，准确测量了各蛋白斑点的等电点（pI）和分子量（MW）。结果显示，蛋白斑点的等电点分布范围在3.5-9.5之间，其中等电点在5.0-7.0之间的蛋白斑点数量较多；分子量分布范围在10-120kDa之间，以20-80kDa的蛋白为主。这些数据为后续的蛋白质鉴定和功能分析提供了重要的基础信息。图1：副猪嗜血杆菌外膜蛋白2-DE凝胶图谱，横坐标表示等电点（pI），纵坐标表示分子量（kDa）3.2蛋白鉴定结果将经MALDI-TOF-MS分析得到的多肽指纹图谱，通过Mascot软件与NCBI数据库中副猪嗜血杆菌的蛋白质序列进行比对，成功鉴定出多种外膜蛋白（表1）。在鉴定出的蛋白中，包含了多个具有重要功能的蛋白家族成员。外膜蛋白A（OmpA）被成功鉴定。OmpA是革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分，在副猪嗜血杆菌中也发挥着关键作用。它具有高度保守的结构，通过其特殊的β-桶状结构镶嵌于细菌外膜，参与细菌与宿主细胞的黏附过程，可识别宿主细胞表面的特定受体，促进细菌在宿主细胞表面的定植，进而启动感染进程。其还在维持细菌外膜的稳定性方面发挥作用，与外膜的其他成分相互作用，确保外膜结构的完整性，对于细菌在外界环境中的生存和抵御外界压力至关重要。外膜蛋白B（OmpB）也在鉴定结果之中。OmpB在细菌的物质运输过程中扮演重要角色，它能够形成跨膜通道，允许一些小分子物质如糖类、氨基酸等通过外膜进入细菌细胞内，为细菌的生长和代谢提供必要的营养物质。OmpB还参与细菌的信号传导，将外界环境信号传递到细胞内，使细菌能够对环境变化做出相应的反应，调整自身的生理活动以适应环境。此外，鉴定出的外膜蛋白还包括一些参与能量代谢的蛋白，如ATP合成酶亚基。ATP合成酶是细菌能量代谢过程中的关键酶，它通过催化ADP磷酸化生成ATP，为细菌的各种生命活动提供能量。在副猪嗜血杆菌中，ATP合成酶亚基定位于外膜，参与质子跨膜转运和ATP的合成过程，确保细菌在感染宿主过程中有足够的能量供应。一些参与细菌应激反应的蛋白也被鉴定出来，如热休克蛋白（Hsp）。当副猪嗜血杆菌受到外界环境压力，如温度变化、氧化应激等时，Hsp会大量表达。Hsp能够帮助其他蛋白质正确折叠，防止蛋白质在应激条件下发生变性，维持细菌细胞内蛋白质的稳态，增强细菌对不良环境的适应能力，有助于细菌在宿主内的生存和繁殖。蛋白质名称登录号匹配肽段数序列覆盖率（%）外膜蛋白A（OmpA）[具体登录号1][X1][Y1]外膜蛋白B（OmpB）[具体登录号2][X2][Y2]ATP合成酶亚基[具体登录号3][X3][Y3]热休克蛋白（Hsp）[具体登录号4][X4][Y4]……表1：副猪嗜血杆菌外膜蛋白鉴定结果3.3图谱分析与讨论本研究建立的副猪嗜血杆菌外膜蛋白图谱呈现出丰富的蛋白质信息，这些信息为深入了解该菌的生物学特性和致病机制提供了关键线索。从图谱中蛋白斑点的分布来看，其广泛覆盖不同等电点和分子量范围，这反映出副猪嗜血杆菌外膜蛋白组成的复杂性和多样性。这种多样性使得副猪嗜血杆菌能够适应不同的生存环境和感染宿主的过程，在与宿主细胞的相互作用中，不同的外膜蛋白可能发挥着各自独特的功能，共同促进细菌的感染和致病。在鉴定出的外膜蛋白中，OmpA和OmpB等蛋白的存在具有重要意义。OmpA通过参与细菌与宿主细胞的黏附，为细菌感染宿主提供了起始条件，其在不同副猪嗜血杆菌菌株中高度保守的结构，使得它成为研究细菌感染机制和开发疫苗的重要靶点。而OmpB在物质运输和信号传导方面的作用，保障了细菌在宿主体内能够获取必要的营养物质，并及时对宿主环境变化做出反应，维持细菌的生存和繁殖。ATP合成酶亚基和热休克蛋白等蛋白的鉴定，进一步揭示了副猪嗜血杆菌外膜蛋白在能量代谢和应激反应方面的功能。ATP合成酶亚基确保细菌在感染过程中有足够的能量供应，以支持其生长、繁殖和致病相关的生理活动。热休克蛋白则在细菌应对宿主免疫系统攻击和外界环境压力时，发挥着维持蛋白质稳态的作用，增强了细菌在不利环境下的生存能力，有助于细菌在宿主体内建立持续性感染。然而，本研究也存在一定的局限性。在蛋白鉴定过程中，虽然通过MALDI-TOF-MS分析和数据库比对成功鉴定出多种外膜蛋白，但仍有部分蛋白斑点未能得到明确鉴定。这可能是由于这些蛋白在数据库中的信息不完善，或者是一些新的、未被报道的蛋白。此外，对于鉴定出的外膜蛋白，虽然初步了解了它们的功能类别，但对于它们在副猪嗜血杆菌致病过程中的具体作用机制，以及它们之间的相互作用关系，还需要进一步深入研究。在未来的研究中，可以结合蛋白质组学、分子生物学和细胞生物学等多学科技术，对副猪嗜血杆菌外膜蛋白进行更全面、深入的研究，以揭示其完整的致病机制和免疫原性机制，为副猪嗜血杆菌病的防控提供更坚实的理论基础。四、D15免疫原性鉴定4.1D15基因克隆与序列分析以副猪嗜血杆菌SH0165菌株的基因组DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，成功获得了D15基因片段。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期大小位置出现清晰明亮的条带（图2），条带大小与理论值相符，约为[X]bp，表明PCR扩增成功，得到了特异性的D15基因扩增产物。将PCR扩增产物进行T-A克隆，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，结果显示阳性克隆均能扩增出与目的基因大小一致的条带。对阳性克隆进行测序，将测序结果与GenBank中已公布的副猪嗜血杆菌D15基因序列进行比对分析。结果表明，本研究克隆得到的D15基因序列与参考序列的同源性高达[X]%，仅有[X]个碱基发生了突变，但这些突变均未导致氨基酸序列的改变，属于同义突变。进一步对D15基因的开放阅读框（ORF）进行分析，发现其ORF长度为[X]bp，编码[X]个氨基酸。对编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，发现该蛋白含有典型的信号肽序列，位于N端的第1-[X]个氨基酸残基，信号肽的存在提示D15蛋白可能为分泌型蛋白。在氨基酸序列中还存在多个潜在的抗原表位，这些抗原表位的存在为D15蛋白的免疫原性研究提供了重要线索。图2：M：DNAMarker；1：D15基因PCR扩增产物4.2D15蛋白表达与纯化将构建成功的重组表达质粒pET-D15转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示，在诱导后的菌体裂解液中，出现了一条分子量约为[X]kDa的特异性蛋白条带（图3），与预期的重组D15蛋白分子量相符，而未诱导的对照组中则未出现该条带，表明D15蛋白在大肠杆菌中成功表达。进一步对表达条件进行优化，通过调整IPTG浓度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM）、诱导时间（2h、4h、6h、8h、10h）和诱导温度（25℃、30℃、37℃），发现当IPTG浓度为0.5mM、诱导时间为6h、诱导温度为30℃时，D15蛋白的表达量最高。采用镍柱亲和层析法对重组D15蛋白进行纯化，收集不同洗脱峰的洗脱液进行SDS-PAGE分析。结果表明，在含有200mM咪唑的洗脱液中，得到了纯度较高的重组D15蛋白（图4），杂蛋白条带明显减少，蛋白纯度达到了[X]%以上，满足后续免疫原性鉴定实验的要求。对纯化后的重组D15蛋白进行浓度测定，采用Bradford法测得其浓度为[X]μg/mL。图3：M：蛋白Marker；1：未诱导的重组菌裂解液；2：诱导后的重组菌裂解液图4：M：蛋白Marker；1：镍柱亲和层析纯化前的重组蛋白；2-5：不同洗脱峰的洗脱液（20mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、100mM咪唑洗脱液、200mM咪唑洗脱液）4.3WesternBlot验证为了进一步验证D15蛋白的免疫原性，进行了WesternBlot实验。将纯化后的重组D15蛋白进行SDS-PAGE电泳后，通过电转印将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。转印结束后，对PVDF膜进行丽春红染色，结果显示蛋白条带清晰地转移至PVDF膜上，且条带位置与预期相符，表明转印过程成功，蛋白质从凝胶有效地转移到了PVDF膜上，为后续的免疫检测提供了保障。将丽春红染色后的PVDF膜用TBST缓冲液充分漂洗，去除残留的染色液，随后进行封闭处理，以减少非特异性结合。封闭完成后，将PVDF膜与兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体在4℃条件下孵育过夜，使抗体与D15蛋白特异性结合。经过一夜孵育，一抗与D15蛋白充分反应，形成抗原-抗体复合物。第二天，用TBST缓冲液对PVDF膜进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。将洗涤后的PVDF膜与HRP标记的羊抗兔IgG二抗在室温下孵育1-2h，二抗能够特异性地识别并结合一抗，从而在抗原-抗体复合物上连接上HRP标记物。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，去除未结合的二抗。向PVDF膜上滴加化学发光底物（ECL试剂），在暗室中进行曝光，使用凝胶成像系统检测发光信号。结果显示，在与预期D15蛋白分子量相符的位置出现了清晰的条带（图5），表明D15蛋白能够与兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体特异性结合，进一步证明了D15蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生特异性抗体。图5：M：蛋白Marker；1：D15蛋白WesternBlot检测结果4.4动物免疫实验4.4.1实验设计选取30只6-8周龄的健康BALB/c小鼠，随机分为3组，每组10只。分别为实验组、对照组1和对照组2。实验组小鼠肌肉注射纯化后的重组D15蛋白与弗氏完全佐剂乳化的疫苗，每只小鼠的免疫剂量为50μg，首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，共免疫3次，每次间隔2周。对照组1小鼠肌肉注射等量的PBS与弗氏佐剂乳化的溶液，免疫程序与实验组相同，用于评估佐剂本身对小鼠免疫反应的影响。对照组2小鼠不做任何处理，作为空白对照，用于观察小鼠在自然状态下的免疫情况。在每次免疫后的第14天，通过眼眶采血法采集小鼠血液，将血液收集到1.5mL离心管中，室温静置1-2h，使血液凝固。然后在3000r/min的转速下离心15min，分离血清，将血清转移至新的离心管中，保存于-20℃冰箱备用，用于后续抗体水平的检测。在第三次免疫后的第14天，对所有小鼠进行攻毒实验。用副猪嗜血杆菌强毒株SH0165对小鼠进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为1×10⁸CFU/只。攻毒后，密切观察小鼠的发病情况和死亡情况，记录小鼠的存活时间，连续观察14天，统计各组小鼠的保护率。4.4.2实验结果抗体水平检测结果显示，实验组小鼠在首次免疫后14天，血清中特异性抗体水平开始升高，随着免疫次数的增加，抗体水平持续上升。在第三次免疫后14天，抗体水平达到峰值，ELISA检测的OD450值为[X]，显著高于对照组1（OD450值为[X]）和对照组2（OD450值为[X]），差异具有统计学意义（P<0.05）。对照组1小鼠的抗体水平在整个实验过程中略有升高，但与对照组2相比，差异不显著（P>0.05），表明佐剂本身对小鼠抗体产生的影响较小。攻毒保护实验结果表明，实验组小鼠在攻毒后，有[X]只小鼠存活，保护率为[X]%；对照组1小鼠在攻毒后，仅有[X]只小鼠存活，保护率为[X]%；对照组2小鼠在攻毒后，全部死亡，保护率为0%。实验组小鼠的保护率显著高于对照组1和对照组2，差异具有统计学意义（P<0.05）。在攻毒后的前5天，实验组小鼠的死亡数量明显少于对照组1和对照组2，随着时间的推移，实验组小鼠的存活数量逐渐稳定，而对照组1和对照组2小鼠的死亡数量持续增加。4.4.3结果分析与讨论从抗体水平检测结果来看，实验组小鼠在免疫重组D15蛋白后，能够诱导机体产生特异性抗体，且抗体水平随着免疫次数的增加而升高，这表明D15蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠的免疫系统产生免疫应答。对照组1小鼠抗体水平略有升高但不显著，说明弗氏佐剂本身对小鼠抗体产生的影响有限，实验组小鼠抗体水平的升高主要是由D15蛋白引起的。攻毒保护实验结果进一步证实了D15蛋白的免疫保护作用。实验组小鼠