生物化学和分子生物学：第十六章 RNA的生物合成

第十六章RNA的生物合成RNABiosynthesisRNA的分子组成RNADNA单链

双链

核糖

脱氧核糖

尿嘧啶

胸腺嘧啶RNA的分类参与蛋白质合成的RNAs:

mRNA,tRNA,rRNA,7SLRNAorSRPRNA,etc.参与RNA加工的RNAs:

snRNA,snoRNA,gRNA,etc.调控RNAs:miRNA,siRNA,piRNA,etc.基因组RNA:RNA病毒参与逆转录的RNAs:逆转录病毒基因组RNA,反转坐子,端粒酶RNA.转录(transcription):生物体以DNA为模板合成RNA的过程。

转录RNADNA

本章主要内容:1.原核生物的转录装置2.原核生物的转录过程3.真核生物的转录装置4.真核生物转录过程5.真核生物RNA的加工6.真核生物mRNA的降解途径ParentalDNADaughter

DNATemplateStrandSenseDNARNAPolmRNADNAreplicationvstranscriptionTemplateStrandSenseDNARNAPolmRNA2.无需引物合成4.保真性低1.RNA聚合酶识别启动子3.合成方向5’

3’5.选择性转录6.转录受到高度调控7.不对称转录转录的主要特征原核生物转录的模板和酶Templates&EnzymesinProkaryoticTranscription第一节

不对称转录(asymmetrictranscription)：DNA分子双链中的一股链用作模板指导转录，另一股链不转录;不同基因的模板链并非总在同一单链上。

一、原核生物转录的模板5

3

3

5

模板链编码链编码链模板链转录方向转录方向5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译DNA双链中按碱基配对规律指引RNA转录生成的一股单链，称为模板链(templatestrand);另一股单链则称为编码链(codingstrand)。

二、原核生物RNA聚合酶由多个亚基组成核心酶

(coreenzyme)全酶

(holoenzyme)

转录起始阶段转录延长阶段

+三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起动转录PribnowboxE.coli启动子的共有序列(consensussequence)

存在多种σ亚基全酶的不同是因为σ亚基的不同

不同的σ亚基用于不同的基因转录

启动子识别区-35region-10regionσ70

辨认典型转录起始点的基因TTGACATTATAATσ32

启动热休克诱导基因转录TCTCNCCCTTGAACCCCATNTAσ28

辨认启动运动基因转录CTAAACCGATAT

-24region-12regionσ54

辨认启动氮代谢基因转录CTGGNATTGCARNA聚合酶保护法开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATATATTA-10区1-30-5010-10-40-205

3

3

5

RNA-pol辨认位点(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保护区结构基因3

3

用RNA聚合酶保护法研究转录起始区原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote第二节一、转录起始过程二、原核生物的转录延长转录泡(transcriptionbubble):RNA-pol（核心酶)···DNA···RNARNA-DNA杂合双链长度~8bp依赖Rho因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止三、原核生物的转录终止依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为:由同亚基组成六聚体蛋白结合RNA,对polyC结合力最强具有ATP酶和解螺旋酶活性（一)ρ因子依赖ρ因子转录终止的作用机制:ρ因子与转录产物结合诱导RNA聚合酶构象变化,RNA聚合酶合成停顿,解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离,RNA产物从转录复合物中释放

。

（二)非依赖ρ因子的转录终止子(terminator)GC-rich反向重复序列;(U)6~8序列紧随其后

GC-richregionGC-richregion1.茎环结构使RNA聚合酶变构，转录停顿;2.转录空泡中A:U配对的DNA/RNA杂化链不稳定，复合物解离，RNA产物释放。

5´pppG53

35RNA-pol非依赖ρ因子转录终止的作用机制:

转录中的大肠杆菌mRNA1.同一DNA模板上多个转录同时进行2.转录与翻译偶联)。

原核生物RNA聚合酶抑制剂利福平:专一性地结合细菌RNA聚合酶β亚基，阻断RNA合成延伸。

真核生物RNA的生物合成TheBiosynthesisofEukaryoticRNA第三节

模板DNARNAPol

通用转录因子

特异性转录因子一、真核生物的RNA聚合酶种类ⅠⅡⅢ转录产物rRNA的前体45SrRNAmRNA前体lncRNA,piRNA,miRNA，snRNA

tRNA5SrRNA对鹅膏蕈碱的反应耐受敏感高浓度下敏感细胞内定位核仁核内核内a-鹅膏蕈碱与polII相互作用、降低聚合酶的转位以及RNA的合成速率。a-鹅膏蕈碱可用于区分RNAPol的类型b’andb-like亚基a-like亚基共有亚基特异性亚基IIIIII+5+4+7E.colicoreRNApolymeraseEukaryoticRNApolymerasesEukaryoticRNAPolvsProkaryoticPol几十个七肽重复单位Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-SerRNA聚合酶Ⅱ含有一个独特的CTD尾最大亚基的羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD),在转录和RNA加工中发挥关键作用转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子AATAAA切离加尾转录终止点修饰点OCT-1核心启动子上游调控元件（启动子近端元件）（远端调控元件）Initiator(Intr)二、转录调控元件TATAbox:位于-30bp处，核心启动子，共有序列TATAAA，决定转录起始点CAATbox:位于-40~-100bp处，共有序列GGGTCAATCT，控制转录起始的频率。

GCbox:位于CAAT框邻侧，共有序列GGCGGG，控制转录调控效率

真核生物转录起始需要RNApol对核心启动子DNA序列进行辨认和结合，生成转录前起始复合体（preinitiationcomplex,PIC)。真核生物的RNApol不能直接识别和结合模板的转录起始区，怎么办？

三、通用转录因子介导RNApol与转录起始区DNA序列的结合generaltranscriptionalfactors(GTFs)参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ转录因子功能TFⅡDTBP亚基结合TATA盒；TAF亚基介导其他特异性转录因子与PIC的相互作用TFⅡA辅助TBP-DNA结合TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物，招募RNApolTFⅡE解螺旋酶，招募TFⅡHTFⅡF与RNApolⅡ结合，RNApolII与其他TFs结合的桥梁TFⅡH解旋酶、蛋白激酶(催化CTD磷酸化)折叠成两个非常相似的结构域,识别、结合TATAbox;引起DNA弯曲、解旋TBP(TATA-bindingprotein)结合DNA的结构XPD和XPB是解旋酶

CAK(cyclin-dependentactivatingkinase)具有激酶活性,磷酸化RNA-polII的CTDTFIIH的结构识别结合上游调控元件如GC盒、CAAT盒等的蛋白因子称为上游因子（upstreamfactor)与远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子，以及在某些特殊生理或病理情况下被诱导产生的可诱导因子（induciblefactor)的参与。可诱导因子和上游因子通常通过辅激活因子(co-activator)或中介子(mediator)与PIC结合

四、特异性转录因子与上游调控元件或远端调控元件结合调控转录效率PolIIIIHIIEIIFIIBTBPTAFIIATATAboxMyoDorHIF1可诱导因子GCorCAATboxSP1orCTF中介子辅激活因子通用转录因子上游因子与RNAPolII介导的转录相关的反式作用因子五、真核生物转录过程2.TFIIB和TFIIA结合到TBP,TFIIA可以增强TFIIB-TBP-DNA稳定性;转录前起始复合体(PIC)的形成1.TFIID结合TATAbox;3.PolII-TFIIF招募到TFIIB-TBP-DNA,TFIIF通过与TFIIB结合介导了PolII与核心启动子的特异性结合;BindingofTFIIBandTFIIABindingofTFIIDBindingofpolII-TFIIFBindingofTFIIEandTFIIHAAA4.TFIIE和TFIIH与复合物结合,PIC形成闭合复合物。

TATAAGTFs+RNAPolII开放复合物延伸终止（与多聚腺苷化偶联)PolII释放、去磷酸化闭合复合物DNA解链,酶磷酸化,转录起始,启动子清除RNA25-30nt时,加帽RNA60-70nt时,TFIIE和TFIIH释放六、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行真核生物转录终止信号知之甚少。真核生物mRNA有聚腺苷酸(polyA)尾巴,是转录后加进去的。转录在加polyA位点下游数百或上千个核苷酸后终止。共同序列AATAAA及其下游GT序列充当多聚腺苷化信号序列。

5------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点5

5

3

33加尾AAAAAAA······3mRNA真核生物转录抑制剂ActinomycinD放线菌素D:参入到dsDNA中连续的GC碱基对中、使DNA变构阻止RNA聚合酶沿模板链的移动，从而抑RNA链的延伸。

RNApolIICTD的磷酸化/去磷酸化修饰对于mRNA的合成、加工及运输是必需的,是转录过程与mRNA加工过程偶联的结构基础真核生物初级转录物不具有功能!真核生物RNA的加工和降解TheprocessingandDegradationofEukaryoticRNA第四节一、核不均一RNA经首、尾修饰和剪接后成为mRNA

（一)前体mRNA在5’-末端加入“帽”结构

帽结构为7-甲基鸟嘌呤,通过5’-5’-三磷酸四酯键与相邻核苷酸相连。

功能:保护mRNA免遭核酸酶的降解;参与mRNA的穿核运输;与帽结合蛋白复合体结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。

加帽过程由加帽酶(cappingenzyme)和甲基转移酶(methyltransferase),催化完成。加帽酶包括磷酸酶和鸟苷转移酶活性。

甲基转移酶SAM（二)前体mRNA在3’端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾

1.加尾修饰与转录终止同时进行。2.mRNA的polyA尾长度通常为100至200个核苷酸之间。3.polyA的有无与长短,是维持mRNA作为翻译模板的活性,以及增加mRNA本身稳定性的因素。4.组蛋白成熟mRNA3’-端不含polyA尾。5.前体mRNA分子的断裂和加polyA尾是多步骤过程。polyA尾的功能:保护mRNA免受核酸酶的降解;辅助转录终止;辅助mRNA出核运输至胞质;是翻译正确起始所依赖的、并调控翻译速率。

前体mRNA断裂点上游10~30nt有AAUAAA信号序列,断裂点下游20~40nt有富含G/U的序列（三)前体mRNA（hnRNA)的剪接主要是去除内含子去除初级转录物上的内含子，把外显子连接为成熟RNA的过程称为mRNA剪接（mRNAsplicing)。

外显子:在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子:隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。

剪接接口(splicingjunction)或边界序列5’剪接位点,内含子以5’-GU起始;分支点序列存在一个高度保守的"A”，位于3’剪接位点上游~30个核苷酸。

5’GU-----------------A----AG3’分支点内含子3’剪接位点,内含子以3’-AG结束;剪接体(spliceosome)是内含子剪接场所剪接体:由核小核糖核蛋白颗粒snRNP和mRNA前体组成,可将前体mRNA的内含子去除。

snRNP(smallnuclearribonucleoproteinparticle):

由一种核小RNA(snRNA)和多种蛋白组成的复合物包括:U1snRNP,U2snRNP,U4snRNP,U5snRNP,U6snRNPsnRNA:

5种类型,U1,U2,U4,U5,U6

100~300ntU-rich剪接体的组装和剪接步骤1.U1和U2snRNA分别与内含子5’端边界序列和分支点序列配对;2.U4-U5-U6复合物加入形成剪接体;4.U1,U4释放;3.内含子弯曲;5.发生第一次转酯反应;6.发生第二次转酯反应;7.外含子连接,套索状内含子释放。

形成套索状RNA的两次转酯反应E1:exon1;E2:exon2分枝点A的2′-OH进攻5′剪接点使磷酸二酯键断裂，同时和intron的5′末端形成一个新的5′–2′磷酸二酯键，套索状RNA形成;5’剪接点exon的3′-OH进攻3’剪接点的磷酸基，释放出套索状内含子

，生成剪接好的成熟mRNA。

（四)前体mRNA可变剪接或剪切产生不同mRNA，是蛋白质多样性的重要机制许多前体mRNA分子经过加工只产生一种成熟的mRNA，翻译成相应的一种多肽；有些则通过选择性使用剪切或（和)剪接位点加工成结构有所不同的mRNA。选择性加工（alternativeprocessing)可变剪接（alternativesplicing)，或选择性剪接可变剪切（alternativecleavage)，或选择性剪切交替剪切交替剪接大鼠降钙素基因转录子的选择性加工降钙素降钙素基因相关肽同一前体mRNA分子通过选择性剪切和剪接:在大鼠甲状腺中产生降钙素，在大鼠脑中产生降钙素-基因相关肽。

（五)mRNA编辑是对基因的编码序列进行转录后加工

在mRNA水平上对外显子加工，通过特定碱基的插入、缺失或置换，使mRNA序列中出现移码突变、错义突变或无义突变，导致mRNA与其DNA模板序列不匹配，使同一前体mRNA翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNAediting)。

人类apoB基因mRNA（14500个核苷酸）肝脏apoB100（分子量为500000）肠道细胞apoB48（分子量为240000）mRNA编辑CAAUAA胞嘧啶核苷脱氨酶APOB基因的mRNA在肝和肠黏膜编码不同多肽链1.RNaseP切除5’端16个核苷酸的前导序列;2.3’端两个核苷酸由RNaseD切除，由核苷酸转移酶加上CCA;3.茎环结构的一些核苷酸碱基经化学修饰为稀有碱基;4.剪接去除内含子。二、真核生物前体tRNA的加工碱基修饰（2）还原反应如：UDHU

（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：A

I

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）三、RNA催化一些真核和原核基因内含子的自剪接

根据基因类型和剪接方式进行的内含子分类:I：某些线粒体、叶绿体及单细胞生物的rRNA前体;一些噬菌体的mRNA前体及细菌tRNA前体;游离的GTP、GDP、GMP提供3’-OH参与转酯反应。II