200年版中国药典无菌检查法

2005年版《中国药典》无菌检查法罗慧萍四川省食品药品检验所2006年7月12006－072005年版无菌检查法介绍2005年版药典无菌检查方法的验证2006－0722005年版无菌检查法介绍2006－073无菌检查基本定义2006－074

无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。

符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。无菌检查环境要求2006－075

无菌检查在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。一般18℃~26℃，相对湿度45％~65％例行消毒处理（试验前、后)定期洁净度检查（一般3～6月一次)洁净度检查2006－076单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的

洁净度须符合无菌检查的要求。

无菌检查培养基2006－077一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制

。培养基的pH值应符合规定，分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳)进行灭菌处理。配制时所用器具应采用洁净玻璃制品，避免增加培养基中的金属离子及其他微量元素而影响微生物的生长，鉴别。制备好的培养基应在2-25℃保存，保存在非密闭容器中，应在3周内使用；保存在密闭容器中，可在1年内使用。

无菌检查培养基2006－078常用培养基及用途硫乙醇酸盐流体培养基：培养好氧菌、厌氧菌。改良马丁琼脂培养基：培养真菌选择性培养基及用途:按硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处

方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂。

中和剂或表面活性剂的加入量应通过验证试验验证。如对氨基苯甲酸：用于磺胺类供试品聚山梨酯80：用于非水溶性供试品β-内酰胺酶：用于β-内酰胺类供试品0.5%葡萄糖肉汤培养基：用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查硫乙醇酸盐流体培养基氧化层颜色的要求2006－079接种前：培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟)，迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。培养后：装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超过培养基深度的1/2。

培养基的装量

直接接种法规定接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,改良马丁培养基每管装量不少于10ml;医用器械体积过大时，培养基用量可在2000ml以上。薄膜过滤法为100ml/管或50ml/管．2006－0710无菌检查培养基2006－0711培养基的适用性检查 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查

符合规定的培养基方可供试品的无菌检查试验。培养基的无菌性检查2006－0712每批培养基随机取不少于5支（瓶)，培养14天，应无菌生长。

本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行，但是，一旦所用培养基不符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为无效。

培养基的灵敏度检查2006－0713硫乙醇酸盐12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支)，另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支)，另1支培养基空白对照。培养5d。结果判定空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。（原3支管有2管生长，合格。)灵敏度检查用菌种2006－0714金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26003】铜绿假单胞菌【CMCC(B)10104】枯草芽孢杆菌【CMCC(B)63501】生孢梭菌【CMCC(B)64941】白色念珠菌【CMCC(F)98001】黑曲霉【CMCC(F)98003】菌液的制备2006－0715取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢

杆菌、生孢梭菌30-35℃培养18-24小时的新鲜培养物,白色念珠菌在23-28℃24-48小时的新鲜培养物,黑曲霉23-28℃培养5-7天的培养物,分别用0.9％无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含

菌数小于100cfu的菌悬液。。

检验量2006－0716批产品出厂最少检验数量供试品注射剂批产量N（个）每种培养基最少检验数量≤10010%或4个（取较多者）100＜N≤50010个＞5002%或20个（取较少者）大体积注射剂（>100ml)2%或10个（取较少者）眼用及其他非注射产品≤2005%或2个（取较多者）＞20010个桶装固体原料2006－≤047每1个7容器续上批产量N（个）每种培养基最少检验数量桶装固体原料4＜N≤5020%或4个容器（取较大者）＞502%或10个容器（取较大者）抗生素固体原料药（≥5克）6个容器医疗器具≤10010%或4件（取较大者）100＜N≤50010件＞5002%或20件（取较少者）182006－07上市抽验样品（液体制剂)的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少量（ml)最少检验数量（瓶或支）≤1006－07全量半量2510半量半量500201<V<5105≤V<201020≤V<501050≤V<1001050≤V<100(静脉给药）10100≤V

≤

5006V

＞

5002196上市抽验样品（固体制剂)的最少检验量供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)供试品装量M（mg/支或瓶)无菌检查方法2006－0721直接接种法

薄膜过滤法:只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。优先采用封闭式薄膜过滤器。

直接接种法9种供试品的处理和接种①一般水溶性供试品取规定量,直接接种至培养基中。②混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量接种至培养基中。③固体制剂供试品

取规定量直接接种,或加入适宜的溶剂溶解,或按标签说明复溶后,取规定量接种至培养基中。

2006－0722直接接种法9种供试品的处理和接种④ß-内酰胺类或磺胺类供试品

取规定量,混合,加入适量的无菌ß-内酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和,接种至培养基中。或接入含ß-内酰胺酶或对氨基苯甲酸的培养基中。

2006－0723直接接种法9种供试品的处理和接种⑤非水溶性供试品

取规定量,混合,加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化,接种至培养基中。或直接接种至含聚山梨

酯80或其它适宜乳化剂的培养基中。

2006－0724直接接种法9种供试品的处理和接种⑥敷料供试品

取规定数量,以无菌操作拆开包装,于不同部位分别剪取约100mg或1cm×3cm的供试品,接种于足以浸没

供试品的适量培养基中。⑦肠线、缝合线等供试品

肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装,无菌拆开包装,接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

2006－0725直接接种法9种供试品的处理和接种⑧灭菌医用器具供试品

取规定量,必要时应将其拆散或切成小碎段,接种于足以浸没供试品的适量培养基中。⑨放射性药品

取供试品1瓶(支),接种于装量为7.5ml的培养基中。每管接种量为0.2ml。

2006－0726薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0727①水溶性供试品

取规定量，直接过滤，或加稀释剂，混匀后，过滤。

有抗菌作用或有防腐剂的供试品，冲洗滤膜不得少于3次。接种培养基封闭式过滤器（三支过滤器)，100ml/支

一般过滤器（一支过滤器)，取出滤膜，分成3份，50ml/管。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0728②固体制剂无菌粉针剂或无菌粉末原料的供试品。

取规定量,加适宜的溶剂溶解或按标签说明复溶,根据其溶解性按水溶

液或非水溶性供试品项下的方法检验。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0729③β-内酰胺类抗生素供试品

取规定量，按水溶性制剂或无菌粉针剂及无菌粉末原料的供试品处理法处理，薄膜过滤，用冲洗液冲洗数次。最后一

次用适量的β-内酰胺酶冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基;或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶的培养基。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0730④非水溶性的供试品

取规定量，直接进行过滤或溶于含适量的聚山梨酯80或其它适宜溶剂的稀释剂中，立即过滤，用聚山梨酯80-0.1%蛋白胨溶液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养基中培养。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0731⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品

取规定量，混合至适量无菌十四烷酸异丙酯中，迅速振摇，使供试品充分溶解，必要时，供试品

可适当加热，温度不超过44℃，趁热迅速过滤。

十四烷酸异丙酯的用量同方法验证试验;无菌十四烷酸异丙酯，将购买的十四烷酸异丙酯用0.22µm脂溶性滤膜过滤即得，该滤膜140℃干热灭菌2h。

若无法过滤，可加入不少于100ml的稀释液，充分震摇萃取，静置，以下层水相作供试液，过滤，以适量冲洗液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养

基培养。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0732⑥无菌气（喷)雾剂供试品

取规定量，将样品容器置冰室冷冻约1小时。速以无菌手续在容器上钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法检验。

薄膜过滤法8种供试品的处理和接种2006－0733⑦装有药物的注射器

取规定量，装上无菌针头（非包装中所配带的)，吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法操作。同时应做包装中所配带的无菌针头的无菌检

查。⑧具有导管的医疗器具（输血、输液袋等)

取规定量，用冲洗液50ml/袋分别冲洗内壁，集中冲洗液于适宜的无菌容器中，薄膜过滤。同时应做包装中所配带的针头的无菌检查。

无菌检查对照试验2006－0734阳性对照

：应根据供试品特性选择阳性对照菌。无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阴性对照

：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作为阴性对照。

培养及观察2006－0735上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长;或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

结果判断以一次检出为准。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定;若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非有证据充分证明检出的微生物非供试品本身所致，原检验结果无效，应重试。

2006－0736结果判断2006－0737当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：

⑴

无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

⑵

回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。⑶

阴性对照管有菌生长。

⑷

供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或)无菌操作技术不当引起的。

2005年版药典无菌检查方法的验证2006－07382005年版药典无菌检查方法的验证2006－0739验证的目的:确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

验证的类型2006－0740前验证:建立药品的无菌检查法再验证:修订检验方法;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时;定期的方法验证.无菌检查方法的验证菌种及菌液制备:同培养基灵敏度检查。

验证方法:同供试品测定，分为薄膜过滤法和直接接种法。无菌检查采用的方法必须与验证方法一致2006－07412005年版药典无菌检查方法的验证2006－0742薄膜过滤法

将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤,冲

洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中,或

将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养

基的容器,加入等量的试验菌,作为阳性对照,按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。

直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养

基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。

2006－07432005年版药典无菌检查方法的验证与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量;增加培养基的用量;使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等;更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。验证试验可与供试品的无菌检查同时进行2006－0744验证结果判断薄膜过滤法的应用2006－0745大容量供试品供试品与培养基混合发生浑浊,不易判断有抑菌作用的供试品验证方法实例2006－0746

胸腺五肽注射液经方法学验证实验,在检验条件下无抑菌作用,