（正式版）DB13∕T 946-2008 《蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术规程》

B41蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体2008-03-28发布2008-04-12实施I本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位：河北省动物疫病预防控制中心、河北省畜牧兽医研究所。1蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术规程1范围本标准规定了蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术中的样本采集、试验准备、试验方法、结果判定等操作方法。本标准适用于用卵黄进行蛋禽H5亚型禽流感灭活疫苗免疫抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术下列术语和定义适用于本标准。蛋禽已经产蛋的禽类。经过直接稀释或氯仿萃取制备好的、用于检测的样品。血凝抑制试验中，同一检样在反应板上出现的前、后孔凝集抑制而中间孔凝集的现象。4样本采集采集蛋禽免疫接种H5亚型禽流感灭活疫苗21d后所产的新鲜禽蛋。5试验准备5.1材料准备5.1.1仪器设备96孔90°V型微量反应板、微量移液器、滴a)葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸等。b)禽流感病毒H5亚型HI抗原、禽流感病毒H5亚型阳性血清和阴性血清。5.2试液配制5.2.1阿氏(Alsevers)称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,用适量蒸馏水溶解后，移入25.2.21%鸡红细胞悬液配制采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.20.01molLPBS洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min,洗涤后用PBS配成1%(V/V)红a)称取磷酸氢二钠2.74g,磷酸二氢钠0.79g,用适量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，定溶。b)量取上述溶液40ml,加入氯化钠8.5g溶解后，移入10005.3检样制备5.3.1卵黄直接稀释5.3.2卵黄氯仿萃取取5.3.1制备好的卵黄检样0.4ml加入等量氯仿，迅速用液体快速混合器30min,3000r/min离心5min,取上清液备6.1抗原血凝效价测定(HA试验，微量法)6.2.1卵黄直接稀释测定法操作方法按GB/T18936执行。用5.3.1中制备的卵黄检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血清和阴性血清对照。6.2.2卵黄氯仿萃取测定法6.2.2.1适用范围在卵黄直接稀释测定法检测出现“跳管”或测不出抗体时，采用卵黄氯仿萃取法检测。操作方法按GB/T18936执行。用5.3.2中制备的检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血清7结果判定7.1试验结果成立条件只有阴性对照孔血清滴度不大于2²,阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。7.2HI滴度的计算方法以完全抑制4个HAU抗原的样本最高稀释倍数作为HI滴度。样本制备过程中卵黄的稀释倍数和7.3判定方法7.3.1卵黄直接稀释测定法结果判定将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加一个滴度为该样本的HI抗体效价(终点滴度为零时则不再加)。举例：微量反应板上血凝抑制的终点滴度是2⁷,则该样本HI抗体效价为28。7.3.2卵黄氯仿萃取测定法结果判定3将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加两个滴度为该样本的HI抗体效价(终点滴度为零