CN119431453A 基于磷(v)的试剂其制备方法以及其在制备立体限定的有机磷(v)化合物中的用途 （百时美施贵宝公司）

201980038200.72019.04.12以及通过使用所述试剂制备有机磷(V)化合物的244和R6如(a)中所定义；Ra3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；c；且3和R6如(a)中所定义；Ra3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；c3C6烷基316烷基3_C8环4bRbb或_CONRbRb；3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；35c3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；3C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；63C6烷基316烷基3_C8环bRbb或_CONRbRb；c；78[0001]本申请是申请日为2019年4月12日、申请号为201[0003]本申请要求于2018年4月13日提交的美国临时申请号62日提交的美国临时申请号62/668,098；于2018年7月13日提交的美国临时申请号62/697,其他应用。通常基于磷原子的氧化态对有机磷化合物进行分类：+5(磷(V))或+3(磷(thiophosphate)(例如硫代磷酸酯(phosphoroth硫代磷酸酯寡核苷酸是寡核苷酸，其中磷酸二酯键中的非交联的氧原子之一被硫原子替[0008]P手性有机硫代磷酸酯在制备包括蛋白质和肽核酸缀合物的生物缀合物中找到了另一种用途。生物缀合物是通过直接共价键小分子药物或大分子药物)连接至功能分子(9(2)增强疾病特异性靶向，(3)降低毒性和(4)控制药物释放曲线。参见Li，F.等人，″BioconjugateTherapeutics：CurrentProgressandFuturePerspective,″Mol[0009]基于有机硫代磷酸酯的键的另一个用途是将这种键结合到环状二核苷酸(CDN)已经将这两种CDN利用模式作为第二信使联系起来，并揭示了它们对塑造人类遗传变异具酸酯核苷间键结合到CDN中赋予CDN有(图1)开发的当前的制备单一异构体寡核苷酸的方法使用了单体单元，这些单体单元包含用活化剂N(氰基甲基)吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(一种吸湿性固体)活化氮以置换，然后可但足够非亲核性以攻击所得的质子化亚磷酰胺并扰乱磷处的立体化学。在Wada的情况下，本公开的化合物是氧杂硫杂磷杂环戊烷硫化物，其实例包括但不限于与CDN和反义寡核苷酸有关的非手性和手性硫代磷酸酯，包括含有硫代和R6如下所定义。和R4和LG如下所定义。和R6如下所定义。[0031]由式(IV)(VIe)中的任一种表示的化合物是由式(I)(IIIe)中的任一种表示的基、3,羟基或5,羟基充当与由式(I)(IIIe)中的任一种表示的化合物反应的亲核试剂。基)酰胺钾(KHMDS)、叔丁醇钾(KOtBu)、双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠[0050]应理解的是，前面的发明内容和下面的具体实施方式都[0051]图1是现有技术的具有立体限定的硫代磷酸酯键的寡核苷酸的Wada合成的示意C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；4和LG如上所述。X1为O2为在另一X1为O2为SX1为S2为SC6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；3_C6环烷基；C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；CD33C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；和R4为氢；X1和CD3CF3216烷基分最终产物或通过从异构纯的起始材料立体有择合成或使用手性辅助试剂而获得，例如，C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；3_C6环烷基；4和Nu如对于式(IV)所述。C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；3_C6环烷基；和R6中任两者与它们所附接的碳一起形成C4_C6环烷基，而其2C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；CD33C6烷基33_bRbb或_CONRbRb；3_C8环烷基；生对靶标的增加的结合亲和力和/或对细胞内核酸酶的增加的抗性和/或向细胞内转运的[0256]具有2/糖修饰的其他有用的核苷包括2/SR和2/NR2基团，其中每个R独立地为[0258]合适的核苷的其他实例包括含硼的核苷，例如特此通过引用以其全文引入的核碱基位于2[S]位。[0265]合适的核苷酸类似物的实例由WO2007/031091(特此通过引用以其全文并入本文)提供或在其中引用。23)_CH1_6烷基2_6烯基2_6烯基2_6炔基或取代的C2_6[0270]合适的双环核苷在WO2007/134181、WO2008/154401、WO2008/150729、WO2009/067647(α_L_双环核酸类似物)和WO2009002_N687,808(Merigan等人)；Sanghvi，AntisenseResearchandApplication，第15章，Zhang等人，Nature，2017，551，644一647(疏水性碱基)；Feldman和Romesberg，2,脱氧2,a硫代甲氧基腺苷三磷酸；2,脱氧2,b氨基腺苷三磷酸；2,脱氧2,b叠氮基腺苷三磷酸；2,脱氧2,b溴腺苷三磷酸；2,脱氧2,b氯腺苷三磷酸；2,脱氧代尿苷；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)2(硫代)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基]假尿苷三磷酸；1{3[2(2氨基乙氧基)乙氧基6丙基假尿苷三磷酸；1甲基6叔丁基假尿苷三磷酸和R4为氢；[0338]在一个实施方案中，本公开的化合物为选自化合物4_1至4_42和化合物4_46的化域普通技术人员通常理解的相同含义。例如，ConciseDictionaryofBiomedicineandandMolecularBiology，第三版，1999年，学术出版社；和OxfordDictionaryof此还公开了其中每个替代方案被单独排除或与其他替代方案以任何组合被排除的那个发的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的那些类似的纯、对映异构体纯或非对映异构体纯)以及对映异构体和立体异构体混合物，例如外消旋学性质，并且保留使一个核酸链与另一个核酸链以序列特异性方式结合的氢键合的性质。糖的本公开的化合物(IV)的实例包括但不限于以苷酸以不同于对其进行纯化方法之前存在的形式或设1-6烷基1-4烷基的杂芳基基团的任选取代的环烷基可以在环烷基环上的任何可用碳原子上与分子的其余26烯基24烯基3环烷基和稠合的任选取代的杂环的任选取代的苯基可以在苯基环上的任何可用碳原子上[0393]术语任选取代的杂芳基包括具有稠合的任选取代的环烷基或稠合的任选取代的壬5烯(DBN)和咪唑、N羟基四氯邻苯二甲酰亚胺(TCNHPI)、N羟基邻苯二甲酰亚胺团的实例包括但不限于乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β一甲氧基乙氧基甲基醚2的基团取代，[0408]在一些实施方案中，本公开的方法包括在从约20℃至约50℃的温度使式(VII)的些实施方案中，反应在非质子溶剂中在从约0℃至约100℃的温度进行约10分钟至约48小C63138bRb3_C8环烷基；C63138bRb3_C8环烷基。[0439]本领域技术人员将理解，可以通过本领域已知的方法制备由式(VII)表示的化合2C63138bRb3_C8环烷基；如上所定义。和R4和LG如上所定义。2S5O6等)可用于以上反应。和LG如上所定义。有机磷(V)化合物可以通过以下制备：将设计成经历裂解的氧杂硫代磷杂环戊烷化合物与缀合物等。亲核试剂的性质和来源也不限于特定分子，2以上式(IV)(VIe)中的任一种表示的化合物。在这些实施方案中，方法包括使由以上式括(a)使式(I)(IIIe)中任一种的化合物与核苷反应[0490]制备立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的方法唯一地适用于制备立体限定的CDN。[0493]本公开还提供了一种用于制备基于纯手性硫代磷酸酯的寡核苷酸及其盐的方[0495]b)使步骤(a)中形成的化合物与另一个核苷反应，从而形成核苷间键(例如，偶域中已知为短分子，其在固相合成技术中用于将固体载体连接至初始合成子分子的官能团，例如羟基。合适的接头公开于例如OligonucleotidesandAnalogues：APractical[0515]可以通过本公开的方法制备的二核苷酸和寡核苷酸的非限制性实例在表5中示[0532]在另一方面，本公开提供了一种制备包含基于P(V)的键的肽/蛋白质_核酸(例如领域已知的方法进行，例如但不限于基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换[0544]本文所述的方法可用于控制有机磷(V)化合物中每个磷原子的构型(例如核苷间PP使用这些方法如何控制构型的实例。本文所述的核酸(寡酸的用途和应用。的。在一个实施方案中，有机磷(V)化合物的每个磷原子可以是大于85％非对映异构体纯的。在一个实施方案中，有机磷(V)化合物的每个磷原子可以是大于90％非对映异构体纯的。在一个实施方案中，有机磷(V)化合物的每个磷原子可以是大于95％非对映异构体纯有机磷(V)化合物的每个磷原子可以是从约60％至约99.9％非对映异构体纯的。在一个实一个实施方案中，有机磷(V)化合物的每个磷原子可以是从约60％至约70％非对映异构体[0548]相对于另一构型的特定构型的量影响有机磷(V)化合物(例如核酸)的三维结构及本公开的精神和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使本发明适应各种用途和条件。[0556]步骤(2)：将混合物在环境温度搅拌过夜。然后将浆液过滤，并将反应器用甲苯(75mL)的混合物冲洗，并将冲洗液施用于滤饼洗涤。将滤饼用水(90mLx2)，然(45mLx2)洗涤。将滤饼在50℃真空干燥15小时。收集到73g为白色固的体硫代磷过滤，并将反应器和滤饼用冷甲醇(1mL)洗涤。将滤饼干燥，并以75％的原样产率称重为[0572]步骤(2)：将来自步骤(1)的批料在约2小时内在真空(200托)下在35_60℃的温度得浆料加热到约60℃,并搅拌直至所有固体溶解。然后将批料在1小时的时间内冷却至20[0574]然后将滤饼(125g)溶解于DCM(0.3L)中。将批料用溶剂交换为庚烷，并蒸馏至[0585]向O,O双(4硝基苯基)S氢二硫代磷酸酯三乙铵盐(4.20mmoL)在乙腈(0.10M)中成察到HCl气泡)。通过简单蒸馏将过量的PCl3蒸馏出，并将化合物真空储存。以定量产率Pδ120.04。[0613]使用方法B制备标题化合物，且LG_H为苯硫醇。1HCCHNMR(500MHz，氯仿d)δ7.32δ3.89[0643]使用方法B制备标题化合物，且LG_H为4_羟基苄腈。1HNMR(600MHz，氯仿_d)δδ7.25HNMR(400MHz，氯仿d)δ16.7，16.3Hz)。HRMS(ESI一TOF)m/z对于C8H8F2OPS3+[M+H]+的计算值284.9437，实测值PNMR31PNMR(202MHz，氯仿d)δ125.13(m)。HRMS(ESI一TOF)m/z对于C8H7Br3OPS3+[M+H]+的计算值482.6941，实测值HNMRHNMR(400MHz，氯仿_d)δ机层再次与10％K2HPO4水溶液(150mL)混合，直至通过HPLC或31PNMR分析完成向产物的转将有机物流过滤通过无水MgSO4垫，并将所得滤液真空浓缩至约35mL。在浓缩期间形成固体。将所得浆液冷却至0℃,搅拌0.5小时并过滤。将滤饼用冷庚烷(10mLx2)洗涤，提供[0681]将1((2S,4S,5R)5(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)4羟基四氢呋喃拌一小时。通过硅藻土过滤反应物，并真空除去溶剂，得到为白色固体的标题化合物[0690]N(叔丁氧基羰基羰基)O((2S,3aS,5R2]氧杂硫杂磷杂环戊二烯2一硫化物(0.10mmol)，接着添加三乙胺(0.10mmol)、DMAP加1((2R,4S,5R)5((双(4甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)4(酸化的肽。7,8二氢9H嘌呤9基)2((((((2R,3S,4R,5R)5[0705]制备树脂结合的三聚体9_iv的程序与上述步骤1相同，除了在该步骤中起始材料是树脂结合的二聚体9_iii并且将反应物在振荡器树脂结合的三聚体9_iv并且将反应物在振荡器上基)氧基)甲基)一5(6氨基9H嘌呤9基)四氢呋喃3基)氧基)硫代磷酰基)氧基)甲8.173分钟。[0738]将小瓶火焰干燥并使其在真空下冷却。然后将小瓶通过气球置于惰性Ar气氛和1((2R,4S,5R)513CNMR(151MHz，CDCl3)δ[0741]将小瓶火焰干燥并使其在真空下冷却。然后将小瓶通过气球置于惰性Ar气氛)δ122.82122.28)δ122.61。[0744]将小瓶火焰干燥并使其在真空下冷却。然后将小瓶通过气球置于惰性Ar气氛)δ123.21。[0747]将小瓶火焰干燥并使其在真空下冷却。然后将小瓶通过气球置于惰性Ar气氛C)δ122.50。[0752]使用dT_Q_CPG500寡核苷酸合成树脂(GlenResearch，20_2030_XX)在BioAutomationMerMadeMM12寡核苷酸合成仪上以2.5μmol规模进行合成。每个合成循环3H)二酮：[0761]使用dT_Q_CPG500寡核苷酸合成树脂(GlenResearch，20_2030_XX)在BioAutomationMerMadeMM12寡核苷酸合成仪上以2.5μmol规模进行合成。每个合成循环行部分浓缩，然后通过凝胶过滤进行脱盐(HiPrep26/10脱盐，柱体积53mLx2个柱分离为蓬松的白色固体，产率为1.3％。LCMS(AquityUPLCOligoBEH，C18，1.7μ,[0769]使用dT_Q_CPG500寡核苷酸合成树脂(GlenResearch，20_2030_XX)在BioAutomationMerMadeMM12寡核苷酸合成仪上以2.5μmol规模进行合成。将17_mer额定的小瓶中。将小瓶加热至55C过夜，以裂解碱基保护基团。将混合物过滤并将滤液在BiotageV10蒸发器上蒸发。样品通过LC/MS分析(A溶剂＝97.5％水/2.5％MeOHw/0.2M当量)。将所得混合物在环境温度搅拌直至反应完成。然后将混合物用己烷(200mL)和水[0786]制备氧化苯乙烯(R)_P(V)试剂(化合物1_14)的程序与制备化合物1_13的(R)_P(V)相同，除了反应中的氧化苯乙烯是(S)_异构体。化合物1_14的手性HPLC保留时间为THF(1.7mL)中的溶液中添加1，8_二氮杂双环[5.4.0]十一碳_7_烯(0.08mL，3.1当量，617。(0.7mL)中的溶液中添加1，8_二氮杂双环[5.4.0]十一碳_7_烯(0.022mL，2.0当量，解于干燥吡啶(100mL)中并真空浓缩。将所得混合物溶于无水DMF(75mL)中，添加TBDPSClTLC评估反应完成后，将混合物真空浓缩。将粗制糖浆溶解于EtOAc(500mL)中，用1NHCl过滤，将固体在50℃,20托干燥，直到达到恒重。分离出作为白色固体的16_ii(20.0g，分离出16_iii(40.0g，67％)，其光谱特征与文献Hutter，D.等人，Nucleosides[0827](+)Ψ是指以下示出的(2R,δ101.0；试剂(4.61g，10.3mmol，1.3当量)于THF(4δ101.4；δ101.5；δ101.49；[0875]HRMS(ESITOF，m/z)：对于[C36H47N2O6PS2Si+H]+的计算值727.2455；实测值δ101.67；粗残余物通过硅胶柱色谱纯化(100％EtOAc至100％THF)，得到为浅黄色固体的化合物3一δ100.5；粗残余物通过硅胶柱色谱纯化(0至100％THF在EtOAc中)，得到为白色固体的化合物3_114δ100.9；δ101.75。δ_202.95。δ101.65。[0921]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于C26H41FN5O4PS2Si[M+H]+的计算值630.2164.；实测值δ_204.21；δ103.12；[0931]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于C26H41FN5O4PS2Si[M+H]+的计算值630.2164.；实测值δ101.42。[0940]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于C48H50N5O7PS2[M+H]+的计算值904.2963；实测值)。δ102.1ppm；[0949]HRMS(ESI_TOF)：calcd.forC47H51N3O8PS2[M+H]+的计算值880.2855；实测值δ100.84。δ100.35。δ100.33。将混合物冷却至0℃,然后在1分钟内逐滴添加1，8一二氮杂双环[5.4.0]十一碳一7一烯(1.5mL，10.03mmol)。将反应混合物在0℃搅拌总共15分钟。将冷的反应混合物用甲苯氟苯基)硫基)_6_(丙_1_烯_2_基)六氢苯并[d][1，3，2]氧均匀。将混合物冷却至0℃。然后将1，8_二氮杂双环[5.4.0]十一碳__7_烯(1.5mL，余物溶于乙酸乙酯(＜5mL)中。将混合物经由Biotage中烯2基)氧基)四氢呋喃2基)5甲基2氧代1，2二氢嘧啶4基)苯甲酰胺(4.95g，PNMR和咪唑(3.14g，46.2mmol，2.0当量)在DMF(30mL)中的溶液中添加TBDPS_Cl(7.39g，75％)分离为白色固体，其光谱特征与文献(Gao，R.等人，Biochemistry43，4S，5R)_4_((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)_5_(羟基甲基)四氢呋喃_2_基)_9H_嘌呤_6_δ53.8；[1017]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C59H65N10O8PSSi2+H]+的计算值1161.4057；实测值时后，UPLC分析显示化合物3_108完全消耗。将反应混合物用EtOAc(25mL)和20％柠檬酸δ54.1；[1026]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C58H65N8O9PSSi2+H]+的计算值1137.3944；实测值δ57.0；[1034]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C52H62N7O9PSSi2+H]+的计算值1048.3679；实测值δ54.3；[1042]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C56H67N10O9PSSi2+H]+的计算值1143.4162，实测值二氢嘧啶_4_基)苯甲酰胺(中间体ii)(1.60g，2后，UPLC分析显示化合物3_109完全消耗。将反应混合物用EtOAc(25mL)和20％柠檬酸残余物通过硅胶柱色谱纯化(20％MeOH于DCM中)，得到为白色固体的产物5_5(1.23g，J=δ54.6；[1050]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C57H65N6O10PSSi2+H]+的计算值1113.3832；实测值δ53.5；[1058]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C51H62N5O10PSSi2+H]+的计算值1024.3566，实测值基二苯基甲硅烷基)氧基)_5_(羟基甲基)四氢呋喃_2_基)_6_羟基_9H_嘌呤_2_基)异丁酰δ54.78；[1066]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C55H67N8O10PSSi2+H]+的计算值1119.4050；实测值δ53.01；[1074]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C52H63N4O11PSSi2+H]+的计算值1039.3563；实测值基)氧基)_5_(羟基甲基)四氢呋喃_2_基)_6_羟基_9H_嘌呤_2_基)异丁酰胺(中间体17_δ54.1；[1090]HRMS(ESI_TOF，m/z)：对于[C57H67N10O11PSSi2+H]+的计算值1187.4060；实测值制的TIPS_1，3_二苯基_3_TIPS_1_二丙二醇。将粗制的TIPS封端的二醇溶解于50mL的THF用30mL的NH4Cl水溶液洗涤3次。使用30mL10％NaOH从MTBE相中萃取产物3次。立即使用浓模，约600mL)反萃取多次，并将有机物合并，干燥并浓缩，得到为粘性物的纯三乙铵盐31PNMR[1149]通过使用与制备化合物18_7f相同的化学方法制备标题化合物。1HNMR(400MHz，[1162]向P(V)试剂(过量)和核苷(1.0当量)在MeCN或THF或[1169]向P(V)试剂(1.3当量)和核苷(1.0当量)在MeCN(0.1M)中的溶液中逐滴添加DBUJ=[1181