CN119431604A 用于dna碱基编辑的方法和组合物 （先正达农作物保护股份公司）

PCT/CN2019/1080262019.09.202080081866.32020.09.18本发明涉及用于修饰细胞的基因组中的靶合蛋白包括通过改进的接头序列连接的一种或多种DNA结合结构域和一种或多种异源结构域，如DNA修饰结构域。提供了密码子优化的多核苷连接的一种或多种DNA结合结构域和一种或多种23变化外，基因组的变化是限制实现所期望的变化所面临的一个问题。CRISPR_CAS9通过对DNA进行双链切割起作用。由于这种断裂通过非同源末端连接或同源依赖性修复来进行修2017.Nat.Biotechnol.[自然生物技术]35,441_443)2018.Nat.Biotechnol.[自然生物技术]36,324_327)酶靶向特定碱基，将CAS9或进行修饰以使其不能切割DNA。胞苷脱氨酶和核酸酶缺陷型CAS9或CAS12a通过氨基酸接头酸序列。4[0008]异源结构域和Cas12a酶之间的第一接头序列可以包含重复至少三次的GGGGS。在[0011]我们还提供了编辑具有减少的脱靶编辑的植物基因组DNA的方法，该方法通过将选地包含UGI结构域；以及(b)将步骤(a)的融合蛋白靶向至植物基因组DNA的靶DNA序列的[0012]我们还提供了通过以下来获得具有减少的脱靶编辑(a)获得包含待编辑的基因组DNA的植物细胞的群体；(b)获得编码如通过以其中脱氨酶(3)通过XTEN接头(4)可操作地与LbCas12a(5)连接。图1B显示出以5'至3'方向54S)6接头(8)可操作地与Mb2Cas12a(9)连接。[0014]图2显示出以5'至3'方向的DNA构建体的示意性图示，该DNA构建体包含Cas12aBE[0024]SEQIDNO:9为核苷酸序列，该核苷酸序列包含表达盒prSoUbi4:SV40NLS:cLbCas12aBE:GS6接头:SV40NLS:SGGS接头:UGI:SGGS接头[0029]SEQIDNO:14为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25057的融合蛋白[0030]SEQIDNO:15为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25057的融合蛋白[0031]SEQIDNO:16为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25058的融合蛋白[0032]SEQIDNO:17为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25058的融合蛋白[0033]SEQIDNO:18为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体24524的融合蛋白[0034]SEQIDNO:19为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体24524的融合蛋白[0038]SEQIDNO:23为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体24904的融合蛋白6[0039]SEQIDNO:24为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体24904的融合蛋白[0047]SEQIDNO:32为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体24523的融合蛋白[0048]SEQIDNO:33为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体24523的融合蛋白[0049]SEQIDNO:34为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25181的融合蛋白[0050]SEQIDNO:35为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25181的融合蛋白[0051]SEQIDNO:36为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25205的融合蛋白[0052]SEQIDNO:37为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25205的融合蛋白[0053]SEQIDNO:38为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25513的融合蛋白[0054]SEQIDNO:39为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25513的融合蛋白[0055]SEQIDNO:40为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25220的融合蛋白[0056]SEQIDNO:41为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25220的融合蛋白[0057]SEQIDNO:42为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25382的融合蛋白[0058]SEQIDNO:43为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25382的融合蛋白7[0064]SEQIDNO:49为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25457的融合蛋白[0065]SEQIDNO:50为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25457的融合蛋白[0066]SEQIDNO:51为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25268的融合蛋白[0067]SEQIDNO:52为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25268的融合蛋白[0068]SEQIDNO:53为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25173的融合蛋白[0069]SEQIDNO:54为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25173的融合蛋白[0070]SEQIDNO:55为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25175的融合蛋白[0071]SEQIDNO:56为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25175的融合蛋白[0072]SEQIDNO:57为具有优化的(G4SG)6接头的无催化活性的LbCas12a的氨基酸序[0081]SEQIDNO:66为具有优化的(G4SG)6接头的无催化活性的Mb2Cas12a的氨基酸序[0083]SEQIDNO:68为具有优化的(G4SG)6接头的无催化活性的AsCas12a的氨基酸序起使用的Cas12acrRNA序列。[0090]SEQIDNO:75为核苷酸序列，该核苷酸序列包含与GL2靶序列一起使用的Cas8[0091]SEQIDNO:76为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体24785的融合蛋白[0092]SEQIDNO:77为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体24785的融合蛋白[0093]SEQIDNO:78为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25459的融合蛋白[0094]SEQIDNO:79为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25459的融合蛋白[0095]SEQIDNO:80为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25504的融合蛋白[0096]SEQIDNO:81为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25504的融合蛋白[0097]SEQIDNO:82为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25289的融合蛋白[0098]SEQIDNO:83为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25289的融合蛋白[0099]SEQIDNO:84为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25658的融合蛋白[0100]SEQIDNO:85为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25658的融合蛋白[0101]SEQIDNO:86为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25701的融合蛋白[0102]SEQIDNO:87为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25701的融合蛋白[0103]SEQIDNO:88为核苷酸序列，该核苷酸序列包含来自构建体25702的融合蛋白[0104]SEQIDNO:89为氨基酸序列，该氨基酸序列包含来自构建体25702的融合蛋白9定实施例的目的[0111]提供以下的定义和方法以更好地定义本发明并且在本发明的实践中指导本领域GlossaryofGenetics:ClassicalandMolecular[遗传学词汇表：标准和分子]，第5版，作连接的任何其他蛋白质结构域。此类目的蛋白包括但不限于定点核酸酶(例如，Cas9、盖该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。参见，例如，DiagnosticMolecularMicrobiology:PrinciplesandApplications[诊断分子微生物学：原理与应用],D.H.PERSING等人编辑,AmericanSocietyforMicrobiology[美国微生物学会],华盛顿织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同RNA(例如反义RNA或非翻译RNA)进行编码。表达盒还可以包含在指导目的核苷酸序列表达中不需要的序列，但是其因为用于将表达盒从表达载体去除的方便的限制性位点而存在。自然界中未一起发现的调节序列和编码序列，或2)编码不天然邻接的蛋白的部分的序列，源自与将其引入的细胞所属的生物体或物种不同的生物体或物种的核苷酸序列相对于那个非限制性实例，启动子可以与一种或多种调节元件和/或编码序列组合存在于核酸构建功能RNA处于启动子的转录控制之下)，则启动子与编码序列或者功能RNA是可操作地连接GFP的核苷酸序列可操作地连接的启动子将能够影响GFP核苷引物对或引物组可以用于核酸分子的扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他核酸[0130]“探针”是互补于靶核酸分子的一部分的分离的核酸分子，并且典型地用于检测靶核酸序列的存在或定量靶核酸序列的量的聚酰胺类以及其他探针PCR热循环仪中检测到的荧光与释放的荧光团和PCR中存在的DN[0132]引物和探针的长度一般在5和100个核苷酸或更多核苷酸30个核苷酸或更多。这些引物和探针在本领域已知的最佳杂交条件下与靶序列特异性杂[0133]用于制备和使用探针和引物的方法描述于，例如，MolecularCloning:HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,原始DNA链作为模板开始合成(5'至3'方向)。反应混合物必须含有全部四种脱氧核苷酸三[0135]寡核苷酸引物对的寡核苷酸互补于位于相对DNA链上和待扩增区域侧翼的DNA序于合成所期望的长度的互补链的模板(5'端由引物定义并且3'端是固定的，因为合成不能和定量二者。数量可以是拷贝的绝对数量或是当归一化到DNA输入或额外的归一化基因时剪接变体的表达分析和石蜡包埋组织中的基因表达以及激光捕获的物转化方法的一般指南包括Miki等人，(“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants[将外源DNA引入植物中的程序]”在PlantMolecularBiologyand(CRC出版有限公司(CRCPress,Inc.)，波卡拉顿(BocaRaton)，1993)，第67_88页)和Rakowoczy_Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.[细胞分子生物学快报]7:849_858许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带目的外源DNA的二元载色体地携带的vir基因的互补体(Uknes等人,1993,PlantCell[植物细胞]5:159_169)。可以使用携带重组二元载体的大肠杆菌，辅助大肠杆菌菌株将重组二元载体移动到靶农杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序，来实现将重组二元载体转移至农杆菌。可替代地，可以通过核酸转化将重组二元载体转移至农杆菌中([0146]通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及农杆菌与来自并且遵循本领域熟知的方法。典型地在携带位于这些二元质粒T_DNA边界之间的抗生素或[0149]如本文使用的，在被引入细胞中的多核苷酸的上下文中，“稳定引入(stablyintroducing、stablyintroduced)”、“稳定转化(stabletransformation或stably苷酸至例如叶绿体基因组中的整合。如本文使用的稳定转化还可以是指被保持在染色体[0150]瞬时转化可以通过例如酶联免疫测定(ELISA)或蛋白质印迹来进行检测，这两种过例如细胞的RNA与核酸序列(这些序列与引入植物或其他生物体的核酸分子的核苷酸序链式反应(PCR)或本领域内熟知的其他扩增反应来进行检测，该反应采用与核酸分子的一以根据标准方法进行检测。转化还可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案进行检且如本文描述进行转化并且可以使用多种已知技术中的任一种来从这些经转化的细胞再如Evans等人(HandbookofPlantCellCultures[植物细胞培养手册],第1卷,麦克米兰出版和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方[0152]“转化和再生过程”是指将转基因稳定地引入植物细胞并从转基因植物细胞再生转化的细胞已经并入并表达转基因，使得转化的细胞将在选择剂存在下存活并发育繁盛。的)长成整个植物。合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.[核酸研究]19:5081[0157]如本文使用的“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例[计算分子生物学](Lesk,A.M.,编辑)OxfordUniversityPress[牛津大学出版社],纽约目](Smith,D.W.,编辑)Aca辑)HumanaPress[胡马纳出版社]，新泽西(1994)；SequenceAnalysisinMolecular上存在实质一致性。在一些具体实施例中，这些序列在至少约150个残基上是基本上同一例中，基本上同一的核苷酸序列或蛋白序列[0161]用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员所熟知的并且可以由以下表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸[0162]用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenter得分阈值(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于初始搜索以发现值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,[0163]除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计见于TijssenLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology_HybridizationwithNucleicAcid[生物化学和分子生物学实验室技术_使用核酸探针的nucleicacidprobea的热熔点(Tm)低约5℃。[0166]Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH迹中在滤器上具有超过100个互补残基)的杂交的严格杂交条件的一个实例是在42℃下具有1mg肝素的50％甲酰胺，其中杂交是过夜进行的。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的中严格洗涤的实例是在45℃以1xSSC持续15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的一个实例是在在的和/或当与其在其天然环境中的功能相比时具有不同的、修饰的、调节的和/或改变的功能的并且因此不是天然的产物的核酸分子、核苷酸序列或多肽。分离的核酸分子或分离苷酸也是被分离的。本发明的重组核酸分子和核苷酸序列可以被认为是如上文所定义的酸分子或核苷酸序列不与在其衍生而来的生物体的天然存在的基因组中的与其邻近的核的转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制编码序列的表达。“启动子调节序列”异源元件以增强启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操初级或次级转化株的自体受精或初级或次级转化株与其他转化或未转化植物的杂交衍生在宿主生物体中未发现但通过基因转移被引入该生物体构域为催化结构域，而C末端结构域是假催化结构域(pseudocatalyticdomain)。更具体此，术语APOBEC及其每个家族成员还涵盖与相应野生型APOBEC蛋白具有一定水平(例如，[0185]毛螺科属细菌(Lachnospiraceaebacterium)Cpf1(LbCpf1)为一大组的许多Cpf1“规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)相关(Cas)蛋白”是指与在例如酿脓链球菌 (Streptococcuspyogenes)以及其他细菌中发现的CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)—适应性免疫系统相关的RNA指导的DNA内切核酸酶Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j等。在本发明的一些实施例中，定点DNA结合结构域为来自毛螺科属细菌 拉式菌属物种、硫微螺菌属物种(Thiomicrospirasp.)、腔隙莫拉式菌(Moraxellalacunata)、Methanomethylophilusalvus、丁酸弧菌属物种(Btyrivibriosp.)或口腔拟杆菌属物种(Bacteroidetesoralsp.)的Cas12a蛋白作为融合蛋白的定点DNA一结合结构域提供。[0186]融合蛋白可以包括其他片段，如尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)和核定位序列[0192]本发明还提供了包含编码本发明的指导RNA的核酸序列的核酸分子。核酸分子可[0194]“定点修饰多肽”修饰靶DNA(例如靶DNA的切割或甲基化)和/或与靶DNA缔合的多Cell[细胞]168:328_328.e1,和Shmakov等人,2017,NatRevMicrobiol[自然微生物学综中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)展现出定点酶活性(例如DNA甲基化活性、DNA切割活其中该DNA靶向RNA包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)调节靶DNA内的转录Shmakov等人,2017中披露的那些，或源自其的多肽)可能需要靶DNA中的不同PAM序列。因内切核酸酶结构域和分开的RuvC/RNA酶H结构域相同的结构域构造。Cas9蛋白共享具有保教导了融合至tRNA腺苷脱氨酶的催化受损的Cas9，它可以介导靶DNA序列中A/T至G/C的转以识别广范围的PAM序列(包括NG、GAA和GAT)的变体(Hu等人,2018,Nature[自然],doi:含异源结构域、第一接头序列以及V型CRISPR_Cas酶，其中该第一接头序列包含重复的氨酶结构域为胞苷脱氨酶。在另一方面，胞苷脱氨酶结构域为激活诱导的胞苷脱氨酶[0206]在另一个实施例中，我们提供了编辑具有减少的脱靶编辑的植物基因组DNA的方选地包含UGI结构域；以及(b)将步骤(a)的融合蛋白靶向至植物基因组DNA的靶DNA序列的多种DNA结合结构域和一种或多种DNA修饰结[0209]以下实例提供了多个示意性实施例。根据本披露以及本普通技术人员应当理解以下实例仅仅旨在是示例性的并且可以采用不离开本披露的主题[0210]我们融合了含有D832A/E925A/D1148A突变(下文为“dLbCas12a”，以前称为[0211]在构建体24524的dLbCas12a_BE中，核定位信号(SV40_NLS)在通过XTEN蛋白接头与dLbCas12a连接的APOBEC1的前面，其后是通过SGGS接头与UGI连接的SV40_NLS。还通过码子制造的dLbCas12a_BE的合成序列列出在SEQIDN[0212]在构建体24904的dLbCas12a_BE中，SV40_NLS在通过具有六个GGGGS氨基酸重复(被称为(G4S)x6)的30个氨基酸接头GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:码子制造的dLbCas12a_BE的合成序列列出在SEQIDN(被称为SX)与UGI连接的SV40_NLS。还通过15个氨基酸接头GGGGSGGGGS(被称为(G4S)x3)制造的dLbCas12a_BE合成序列列出在SEQIDNO子制造的dLbCas12a_BE合成序列列出在SEQID基因(cCas9BE_02)连接的胞苷脱氨酶(xAPOBEC1_01)的前面，其后是通过xSGGS接头_02与酶抑制剂xUGI_02通过xSGGS接头_02与核定位信号xSV40NLS_07连接。融合蛋白在甘蔗泛核定位信号也被并入Cas9的C_末端以改进其对核的靶向。cCas9BE_02的合成序列列出在[0218]为产生在玉米Wx1中编辑的潜在的事件，选择优良玉米转化品种NP2222用于所述[0220]将通过电穿孔携带载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株_LBA440417740RecA在含有Gent(25μg/ml)和Spec(100μg/ml)抗生素的YP培养基上划线，_[0223]我们使用Phire植物样品直接PCR预混液(PhirePlantDirectPCR[0238]PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，并且在SangerDNA测序前用特异性引物进[0242]表2.包含APOBEC脱氨酶和dLbCas12a之间的XTEN接头的CRISPR/Cas胞苷碱基编辑器核酸酶之间的XTEN接头的Cas12a碱基编辑器，在位置9、10和22处将半胱氨酸编辑为硫胺[0252]表4显示出具有长接头的Cas12a的碱基编辑效率如何与Cas9的碱基编辑效率相[0255]表5显示出当与XTEN接头或长接头可操作地连接时，LbCas12a碱基编辑器的编辑[0262]使用长接头和Cas12a的组合也大大地改进了大豆编辑。标准Cas12a和长接头一[0272]通过长接头将异源结构域(仅除APOBEC脱氨酶之外)与Cas12a连接也在本发明的[0273]我们将腺嘌呤脱氨酶与Cas12a可操作地连接，以创建Cas12a腺嘌呤碱基编辑器[0274]在构建体25459的dLbCas12a_ABE中，将189bp的马铃薯内含子插入TadA编码序列中，该编码序列前面是通过XTEN蛋白接头连接的TadA变体，以产生TadA二聚体。将其与对核的靶向。使用玉米优化的密码子制造的dLbCas12a_ABE合成序列列出在SEQ