waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解

主讲人:马贵红日期:-07-17高效液相色谱仪操作方法

Waterse2695型waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第1页什么是高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称:HPLC是一个基于仪器方法高效能分离伎俩:高性能色谱柱，高精度、耐高压输液泵以及高灵敏度检测器……广泛应用于各个领域:医药/环境保护/石化/生命科学/食品及农业……在技术，理论及应用上仍处于发展阶段waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第2页定量分析主要基于与标准品比较是其最大应用领域定性分析;不是色谱强项基于样品保留时间比较借助于和其联用紫外、质谱或其它检测器对定量及定性分析要求灵敏度、精度及准确度要求样品量要求;复杂样品分析能力轻易使用什么是高效液相色谱法waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第3页高效液相色谱怎样工作一个储液瓶装有溶剂[称为流动相,因为溶剂是流动]。一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相流速,普通是毫升/分钟。一个进样器[样品管理器或自动进样器]能够将样品导入[注射]连续流动相,并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能取得分离效果填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出众谱柱时被分开谱带[大多数化合物没有颜色,所以人眼观察不到]。流动相流出检测器可被送至废液瓶,或按需被搜集。当流动相含有一个分开化合物谱带,高效液相色谱能够搜集含有纯化化合物该洗脱组分,用于深入分析。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元,形成流动相、样品和化合物分离谱带通路。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第4页检测器连接计算机数据站,高效液相色谱系统单元先统计电信号,再将电信号转换为色谱图,在显示器上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度。因为样品中化合物性质差异很大,几个类型检测器被开发出来。假如一个化合物能吸收紫外光,可使用紫外吸收检测器。假如这个化合物发荧光,可使用荧光检测器。假如该化合物没有上述性质之一,可使用更广泛检测器,如蒸发光散射检测器[ELSD]。最强大方式是次序使用多个检测器。比如,紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离组分。这么,从一次进样,可得到分析物更多综合信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用.高效液相色谱怎样工作waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第5页液相色谱基本流程图流动相

泵色谱柱检测器

泵输液分离

检测

统计AEGBCDF进样阀进样waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第6页液相色谱各部分示意图液相色谱试验所需基本参数--亦称色谱条件流动相:种类及配比，等度或梯度固定相:色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数:流速检测器参数:紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第7页仪器组成及开机溶剂管理系统准备样品管理系统准备运行样品数据采集汇报打印关机Waterse2695型高效液相色谱仪操作方法waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第8页Waterse2695型高效液相色谱仪操作方法仪器组成及开机

1仪器组成Waterse2695分离单元2498型紫外检测器色谱管理工作站打印机

四元梯度洗脱溶剂输送系统四通道在线真空脱气机可容纳120个样品瓶自动进样系统柱温箱内置柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘液晶显示器键盘用户界面及软盘驱动器waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第9页2开机

打开电源至on位置,开机依次接通2695分离单元、检测器、计算机和打印机电源。接通后,约20s仪器开始自检,约1min后,显示主屏幕,此时继续各部件初始化。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第10页溶剂管理系统准备流动相脱气确认全部溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status】，进入“Status（1)”屏幕waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第11页溶剂管理系统准备waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第12页必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水；水相流动相需要每48h重新配制，尤其是100%含水流动相；检验6根管子是否均在液面下，必须确保6根管子全部插到溶剂瓶底部。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第13页打开真空脱气机（degasser)waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第14页Wetprime（执行湿灌注)waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第15页流动相平衡色谱柱同理温度、流速都可在此控制面板设定!waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第16页流动相特征

（1)液相色谱流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离情况；（2)亲水性固定液常采取疏水性流动相，即流动相极性小于固定相极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3)若流动相极性大于固定液极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上出峰次序相反。

惯用溶剂极性次序:

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第17页流动相方面要求除去微粒纯度要求超纯水，梯度试验时水中有机杂质含量要低（提议走空白检验)缓冲液pH值，在填料允许范围内缓冲液（盐)浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中杂质含量注意溶剂相容性，防止使用不相容溶剂流动相对样品溶解度有机溶剂或水百分比waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第18页流动相转换要迟缓流速(压力)改变幅度较小,比较稳定温度改变幅度专用色谱柱∶样品及溶剂要求色谱柱使用及操作waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第19页

装载样品盘（loadingcarousels)：

装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘适当位置，打开样品仓门，显示“DoorisOpen”屏幕，装入样品盘，按【Next】，直至全部样品盘装毕，关仓门。样品管理系统准备waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第20页样品方面要求溶剂和样品过滤非常主要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除因为污染对分析结果影响。色谱柱:因为填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中细小颗粒会使色谱柱和毛细管轻易堵塞。仪器:溶剂和样品中细小颗粒会增加进样阀堵塞和磨损，同时也会增加泵头内蓝宝石活塞杆和活塞磨损。除去微粒及杂质了解样品在流动相中溶解度,如样品溶剂不是流动相，一定要确保样品在流动相中不析出。了解样品与色谱柱基质/填料是否相互作用。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第21页运行样品配置系统项目管理数据（相当于新建文件夹)，鼠标右键选新建，设定项目名（设定后将出现在运行样品中)。建立方法组并运行样品在浏览项目中打开你项目，经过“新建仪器方法”来设定使用仪器方法（即对配置系统一步选定主机和检测器进行参数设置)：仪器方法（新建→仪器方法，包含主机和选定检测器参数设置→设置好选另存为保留此仪器方法→关闭)此时上述编辑仪器方法出现在列表中waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第22页waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第23页运行样品waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第24页在浏览项目中打开你项目，经过“新建方法组”来设定详细仪器方法、处理方法、汇报方法→另存为“方法组”，设置方法名（与刚才仪器方法名相统一)→完成。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第25页在"运行样品”中打开设定仪器方法，并在设针时选定设定方法组来对样品进行分析。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第26页数据处理都能够在"浏览项目”中完成。点开"浏览项目”，选定要要浏览项目，确定后进入界面中有以下内容：样品组、进样、通道、方法、结果组、结果等。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第27页PDA数据处理

在浏览项目中，点“通道”→双击要处理原始数据（点查看图标）→进入查看主窗口→提取色谱图→点“处理方法向导”图标→新建处理方法→峰1.峰2→积分区域（选定要积分峰）→给出条件剔除不要峰→→→……→纯度匹配→PDA光谱对照→处理方法名→完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）→点“方法组”图标，选好后点“文件”下“另存为”→“方法组”，设定即可。至此选好处理方法。结果处理：选好数据，右键选处理→选好方法组（上面设定好）点结果即可给出处理好数据注：通道不论什么时候给出都是未处理数据。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第28页waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第29页waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第30页FD数据处理：点“处理方法向导”图标→新建处理方法→在新方法（方法类型中选LC）→新建处理方法→峰1.峰2→积分区域（选定要积分峰）→给出条件剔除不要峰→→→……→处理方法名→完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）→至此选好处理方法。waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第31页色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram)色谱图即色谱柱流出物经过检测器时所产生响应信号对时间曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间。←色谱峰保留时间（分)基线↓峰高峰宽响应值waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第32页色谱图参数基本概念色谱峰

－Peak色谱柱流出组分经过检测器时产生响应信号微分曲线峰底－PeakBase峰起点与终点之间连接直线峰高－PeakHeight峰最大值到峰底距离峰宽－PeakWidth在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间距离半（高)峰宽－PeakWidthatHalfHeight经过峰高中点作平行于峰底直线，其与峰两侧相交两点之间距离waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第33页峰面积

－PeakArea峰与峰底之间面积,又称响应值标准偏差;σ－StandardError0.607倍峰高处所对应峰宽二分之一拖尾峰

－TailingPeak后沿较前沿平缓不对称峰前伸峰－LeadingPeak前沿较后沿平缓不对称峰鬼峰－GhostPeak并非由试样所产生峰;亦称假峰色谱图参数基本概念waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第34页基线－Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生响应信号曲线基线飘移－BaselineDrift基线随时间定向迟缓改变基线噪声;N－BaselineNoise由各种原因所引发基线波动谱带扩展－BandBroadening因为纵向扩散,传质阻力等原因影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加现象色谱图参数基本概念waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第35页死时间,t0－Deadtime不被固定相滞留组分,从进样到出现峰最大值所需时间保留时间,tR－Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需时间死体积,V0－Deadvolume不被固定相滞留组分,从进样到出现峰最大值所需流动相体积保留体积,VR－Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需流动相体积色谱图参数基本概念waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第36页

在结果中，选择图谱点打印，汇报打印时，选择设定好汇报模式，或者选择"缺醒单个汇报”模式打印，在待打印模式下能够编辑汇报显示信息，比如表头，色谱图显示范围，表格中所需内容等。汇报打印waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第37页waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第38页waters高效液相色谱仪操作方法医学知识讲解第39页关机数据采集完成后,关闭检测器电源开关,以节