生物制品锌盐测定指南（试行）

生物制品锌盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于预防类生物制品（病毒疫苗、细菌疫苗、联合疫苗、基因工程疫苗、佐剂制剂）、治疗类生物制品（抗毒素、抗血清、血液制品、重组蛋白药物、抗体药物、基因治疗产品、细胞治疗产品）、体外诊断类生物制品中总锌及可溶性锌含量的测定，涵盖工艺添加的锌盐（如胰岛素类制剂中作为稳定剂的锌、锌佐剂组分）、生产过程引入的锌残留（如不锈钢生产设备、镀锌管路、原辅材料引入的锌杂质）的定量检测。锌含量在10mg/kg（或10mg/L）以上的样品优先采用络合滴定法，1~100mg/kg（或1~100mg/L）的样品优先采用双硫腙分光光度法，0.1~10mg/kg（或0.1~10mg/L）的样品优先采用火焰原子吸收分光光度法，低于0.1mg/kg（或0.1mg/L）的痕量锌样品优先采用电感耦合等离子体质谱法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0406原子吸收分光光度法《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0401紫外-可见分光光度法《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0701容量分析法GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南3术语和定义3.1锌盐：本指南中锌盐指以游离态、络合态、结合态等各种化学形态存在的含锌化合物的总称，测定结果统一以锌元素计。3.2总锌：生物制品样品经氧化性全消解处理后，测定得到的所有形态锌的总含量。3.3可溶性锌：生物制品样品经12000r/min离心10min、0.22μm水系滤膜过滤后，滤液中测定得到的溶解态锌含量。3.4基质干扰：生物制品中存在的蛋白、核酸、多糖、铝佐剂、缓冲盐、保护剂、稳定剂等组分对锌测定信号产生的抑制或增强效应，可导致测定结果出现偏差。3.5定量限：指样品中锌能够被准确定量测定的最低浓度或含量，对应测定结果的回收率应在90%~110%范围内，相对标准偏差≤10%。3.6检测限：指样品中锌能够被检出的最低浓度或含量，对应信噪比≥3。4方法选择原则4.1含量适配原则：根据样品中锌的预期含量选择灵敏度匹配的检测方法，避免高含量样品采用痕量方法导致的信号过载，或低含量样品采用常量方法导致的检出能力不足。4.2基质适配原则：含高浓度蛋白、铝佐剂、高盐的样品优先选择原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法，减少基质干扰；添加锌作为稳定剂的高锌样品（如重组人胰岛素制剂）优先选择络合滴定法，提高检测效率。4.3合规性原则：当生物制品各论中明确规定锌盐测定方法时，应优先采用各论规定的方法；若需变更方法，应按规定完成方法学验证并符合等效性要求。5检测方法5.1乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）络合滴定法5.1.1方法原理在pH9.5~10.5的氨-氯化铵缓冲体系中，锌离子可与铬黑T指示剂形成稳定的紫红色络合物，该络合物的稳定常数低于EDTA-2Na与锌离子形成的络合物，采用EDTA-2Na标准溶液滴定至终点时，EDTA-2Na完全置换出与铬黑T结合的锌离子，溶液由紫红色变为纯蓝色，根据EDTA-2Na标准溶液的消耗量计算锌含量。5.1.2试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682-2008规定的三级水要求。5.1.2.1EDTA-2Na标准溶液（0.05mol/L）：称取20gEDTA-2Na·2H₂O，加1000mL水溶解，摇匀后标定。标定方法：准确称取800℃灼烧至恒重的基准氧化锌0.12g，精确至0.0001g，加3mL盐酸（1+1）溶解，加25mL水，加1滴0.2%甲基红乙醇溶液，用氨试液（10%氨水）中和至溶液显淡黄色，加25mL水、10mL氨-氯化铵缓冲液（pH10.0），加5滴铬黑T指示剂，用配制的EDTA-2Na溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，30s不褪色，同时做空白试验。EDTA-2Na标准溶液浓度计算公式为：C(EDTA-2Na)=m/[(V₁-V₀)×0.08138]，其中m为基准氧化锌的质量（g），V₁为滴定消耗EDTA-2Na溶液的体积（mL），V₀为空白试验消耗EDTA-2Na溶液的体积（mL），0.08138为与1.00mLEDTA-2Na标准溶液（1.000mol/L）相当的基准氧化锌的质量（g）。标定的平行样相对偏差≤0.1%，浓度值保留4位有效数字。5.1.2.2氨-氯化铵缓冲液（pH10.0）：称取54g氯化铵，加200mL水溶解，加350mL浓氨水，加水稀释至1000mL，摇匀后用酸度计校准pH值。5.1.2.3铬黑T指示剂：称取0.1g铬黑T，加10g氯化钠研磨均匀，密封干燥保存，有效期6个月；或配制0.5%铬黑T三乙醇胺溶液，有效期1个月。5.1.2.4掩蔽剂：20%三乙醇胺溶液（掩蔽Fe³+、Al³+、Sn⁴+），10%硫化钠溶液（掩蔽Cu²+、Pb²+、Hg²+）。5.1.2.5消解试剂：硝酸（优级纯）、高氯酸（优级纯），硝酸-高氯酸混合液（4:1，V/V）。5.1.3仪器设备5.1.3.1分析天平：感量0.1mg。5.1.3.2酸式滴定管：50mL，A级，经校准合格。5.1.3.3可调温电热板：温度范围室温~300℃。5.1.3.4凯氏烧瓶：100mL或250mL。5.1.3.5酸度计：精度±0.02pH单位。5.1.4操作步骤5.1.4.1样品前处理：液体样品准确量取5.0~10.0mL（含锌量≥0.5mg），固体样品准确称取0.5~2.0g（精确至0.0001g，含锌量≥0.5mg），置于凯氏烧瓶中，加10mL硝酸-高氯酸混合液，瓶口放一小漏斗，置于通风橱内电热板上低温加热消解，待溶液变为棕黑色时，补加适量硝酸至有机物完全消解，升高温度继续加热至冒高氯酸白烟，溶液澄清透明呈无色或淡黄色，赶酸至近干（残留液体积约0.5mL），冷却至室温，加20mL水溶解残渣，滴加氨试液调节pH至7左右，转移至150mL锥形瓶中，用水少量多次洗涤凯氏烧瓶，洗液合并至锥形瓶中，最终体积控制在50mL左右。若样品中存在干扰离子，加2mL20%三乙醇胺溶液、1mL10%硫化钠溶液，摇匀后静置5min。含铝佐剂的样品消解时，需待高氯酸白烟冒尽后加1mL盐酸（1+1）溶解铝盐沉淀，再转移至锥形瓶。5.1.4.2滴定：向锥形瓶中加5mL氨-氯化铵缓冲液，加适量铬黑T指示剂（固体指示剂加0.1g，液体指示剂加2滴），摇匀后用EDTA-2Na标准溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，30s不褪色即为终点，记录消耗的EDTA-2Na溶液体积。5.1.4.3空白试验：不加样品，按上述相同步骤操作，记录空白消耗的EDTA-2Na溶液体积。5.1.5结果计算锌含量按以下公式计算：液体样品：X(mg/L)=[(V₁-V₀)×C×65.38]/V样×1000固体样品：X(mg/kg)=[(V₁-V₀)×C×65.38]/m×1000每制剂单位：X(mg/剂)=[(V₁-V₀)×C×65.38]/n×1000其中：V₁为样品滴定消耗EDTA-2Na溶液的体积（mL）；V₀为空白滴定消耗EDTA-2Na溶液的体积（mL）；C为EDTA-2Na标准溶液的浓度（mol/L）；65.38为锌元素的摩尔质量（g/mol）；V样为液体样品的取样体积（mL）；m为固体样品的取样质量（g）；n为取样的制剂单位数（如剂、IU等）。5.1.6方法学要求回收率98.0%~102.0%，重复性相对标准偏差（RSD）≤2.0%，平行样相对偏差≤1.0%。5.1.7注意事项滴定体系pH需严格控制在9.5~10.5范围内，pH过低则铬黑T与锌络合不稳定，终点变色不敏锐；pH过高则易产生氢氧化物沉淀，导致测定结果偏低。若样品中锌含量较低，可将EDTA-2Na标准溶液稀释至0.01mol/L使用，需重新标定浓度。5.2双硫腙分光光度法5.2.1方法原理在pH4.0~5.5的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，锌离子与双硫腙反应生成红色脂溶性络合物，可被四氯化碳萃取，在535nm波长处的吸光度与锌含量成正比，通过标准曲线法计算锌含量。5.2.2试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为优级纯，实验用水符合GB/T6682-2008规定的二级水要求，所有玻璃器皿需经10%硝酸浸泡24h后用超纯水冲洗干净。5.2.2.1锌标准贮备液（1000μg/mL）：准确称取800℃灼烧至恒重的基准氧化锌0.1000g，加5mL盐酸（1+1）溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，4℃密封保存有效期12个月。5.2.2.2锌标准工作液（1.0μg/mL）：临用前将锌标准贮备液用1%硝酸逐级稀释至1.0μg/mL。5.2.2.3双硫腙试剂：称取0.5g双硫腙，溶于100mL四氯化碳中，滤去不溶物，滤液移入250mL分液漏斗中，用100mL稀氨水（1+100）分次萃取，合并氨水层，用稀盐酸（1+10）酸化至pH2~3，此时双硫腙析出，再用四氯化碳萃取3次，每次50mL，合并四氯化碳层，用超纯水洗涤3次，置于棕色瓶中，4℃避光保存作为双硫腙贮备液。临用前用四氯化碳稀释至工作液，535nm波长处透光度为50%。5.2.2.4醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）：称取136g醋酸钠（NaAc·3H₂O），加300mL水溶解，加57mL冰醋酸，加水稀释至1000mL，用双硫腙四氯化碳溶液萃取除去锌杂质，直至有机相无红色，弃去有机相，水相备用。5.2.2.5掩蔽剂：20%盐酸羟胺溶液（除余氯、还原Fe³+），25%硫代硫酸钠溶液（掩蔽Cu²+、Hg²+、Pb²+、Cd²+）。5.2.2.6消解试剂：硝酸（优级纯）、高氯酸（优级纯）、30%过氧化氢（优级纯）。5.2.3仪器设备5.2.3.1紫外-可见分光光度计，配1cm石英比色皿。5.2.3.2125mL分液漏斗，聚四氟乙烯活塞。5.2.3.3可调温电热板、分析天平（感量0.1mg）。5.2.4操作步骤5.2.4.1标准曲线绘制：取6个分液漏斗，分别加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL锌标准工作液（对应锌含量0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg），加水至总体积20mL，加5mL醋酸-醋酸钠缓冲液、1mL20%盐酸羟胺溶液、1mL25%硫代硫酸钠溶液，摇匀后放置2min，加10.0mL双硫腙四氯化碳工作液，剧烈振摇2min，静置分层后弃去上层水相，有机相经脱脂棉过滤至1cm比色皿中，以四氯化碳为参比，在535nm波长处测定吸光度，以锌含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，线性相关系数R≥0.999。5.2.4.2样品前处理：液体样品准确量取1.0~5.0mL（含锌量0.5~5μg），固体样品准确称取0.2~1.0g（含锌量0.5~5μg），置于凯氏烧瓶中，加10mL硝酸、2mL30%过氧化氢，瓶口放小漏斗，低温消解至澄清透明，赶酸至近干，冷却后加20mL水溶解残渣，用醋酸钠溶液调节pH至4.5，转移至分液漏斗中，加水至20mL。测定可溶性锌的样品无需消解，直接过滤后调节pH至4.5即可。5.2.4.3样品测定：按标准曲线绘制相同步骤加入缓冲液、掩蔽剂、双硫腙工作液，萃取后测定吸光度，同时做空白试验。5.2.5结果计算锌含量按以下公式计算：液体样品：X(mg/L)=(A-A₀)×f×V定/V样固体样品：X(mg/kg)=(A-A₀)×f×V定/m其中：A为样品吸光度，A₀为空白吸光度，f为标准曲线斜率倒数（μg/吸光度单位），V定为样品定容体积（mL），V样为液体取样体积（mL），m为固体取样质量（g）。5.2.6方法学要求回收率95.0%~105.0%，重复性RSD≤3.0%，平行样相对偏差≤2.0%，定量限为0.1mg/kg（或0.1mg/L）。5.2.7注意事项双硫腙络合物见光易分解，整个操作过程需避光；硫代硫酸钠掩蔽剂需足量，避免其他重金属离子干扰；萃取时振摇力度和时间需保持一致，保证萃取完全。5.3火焰原子吸收分光光度法（FAAS）5.3.1方法原理样品经消解后导入原子吸收分光光度计的空气-乙炔贫燃火焰中，锌化合物原子化产生基态锌原子，吸收锌空心阴极灯发射的213.9nm特征谱线，吸光度与锌含量成正比，通过标准曲线法计算锌含量。5.3.2试剂与材料所有试剂为优级纯，实验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm的超纯水，所有器皿经20%硝酸浸泡24h后用超纯水冲洗干净。锌标准贮备液（1000μg/mL），锌标准工作液（10μg/mL，临用前用1%硝酸稀释），1%硝酸溶液（v/v，优级纯硝酸配制），消解试剂为优级纯硝酸、30%过氧化氢。5.3.3仪器设备原子吸收分光光度计（配锌空心阴极灯、空气-乙炔火焰装置），微波消解仪或可调温电热板，分析天平（感量0.1mg）。5.3.4操作步骤5.3.4.1仪器条件：波长213.9nm，灯电流3~5mA，狭缝宽度0.5nm，空气流量6.0L/min，乙炔流量1.2L/min，燃烧头高度6mm，读数方式为峰面积，积分时间3s。5.3.4.2标准曲线绘制：用1%硝酸配制浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/mL的锌标准系列，按仪器条件测定吸光度，绘制标准曲线，线性相关系数R≥0.9995。5.3.4.3样品前处理：微波消解取0.5mL液体样品或0.2g固体样品，加5mL硝酸、2mL过氧化氢，密封后按程序升温（120℃保持5min，150℃保持5min，180℃保持15min）消解，冷却后赶酸至近干，用1%硝酸定容至10mL。电热板消解按双硫腙法前处理步骤操作。5.3.4.4样品测定：与标准系列相同条件测定吸光度，同时做空白试验。5.3.5结果计算：根据标准曲线查得样品中锌浓度，乘以稀释倍数计算含量，公式同分光光度法。5.3.6方法学要求：回收率92.0%~108.0%，重复性RSD≤5.0%，定量限0.05mg/kg（或0.05mg/L）。5.3.7注意事项：锌为环境中常见元素，需严格控制器皿和试剂污染；含高盐基质的样品可加入0.1%镧溶液作为基体改进剂消除干扰。5.4电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）5.4.1方法原理样品经消解后进入ICP-MS等离子体，经离子化后按质荷比分离，选择66Zn作为测定同位素（避免12C40Ar对64Zn的干扰），其信号计数与锌含量成正比，采用内标法（115In为内标）校正基质效应，计算锌含量。5.4.2试剂与材料：UP级硝酸、超纯水、1μg/mL铟内标溶液、锌标准贮备液。5.4.3仪器设备：ICP-MS仪、微波消解仪。5.4.4操作步骤：配制0、0.1、1、10、50、100ng/mL的锌标准系列，内标铟浓度为10ng/mL，仪器条件为射频功率1550W，等离子体气流量15L/min，载气流量1.0L/min，采样深度8mm，测定66Zn和115In的计数，绘制标准曲线R≥0.9999。样品前处理同FAAS法，定容后上机测定。5.4.5方法学要求：回收率90.0%~110.0%，重复性RSD≤10.0%，定量限0.001mg/kg（或0.001mg/L）。6方法学验证要求6.1专属性：向空白基质中加入限量浓度的锌，同时添加生物制品常见辅料（铝盐10mg/mL、氯化钠9mg/mL、蔗糖50mg/mL、白蛋白100mg/mL），测定回收率符合对应方法要求，证明无明显干扰。6.2准确度：采用加标回收法，设置低、中、高三个浓度水平（分别为限量的50%、100%、150%），每个水平平行6份，回收率符合各方法要求。6.3精密度：重复性为同一人员6次平行测