生物制品异常毒性检查指南（试行）

生物制品异常毒性检查指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素/抗血清类、血液制品类、重组蛋白/多肽类、细胞治疗产品、基因治疗产品、微生态制品、毒素类等所有按照生物制品管理的产品，在注册申报检验、上市后批签发检验、监督抽检、生产过程中间品质量控制、上市后不良反应回溯检验等场景下的异常毒性检查工作。本指南为《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）三部通用技术要求的细化补充，所有检查工作需同时符合国家药品监督管理局发布的生物制品相关技术规范、产品注册标准要求，未尽事宜参照《中国药典》三部通用规则执行。2基本要求2.1人员要求所有参与异常毒性检查的人员需持有实验动物从业人员资格证书，经过生物制品检验操作、动物实验伦理、生物安全防护专项培训并考核合格，每次实验至少2名操作人员共同参与，其中至少1名具有3年以上生物制品动物实验相关工作经验，能够准确识别实验动物的正常生理状态与异常毒性反应。操作人员需无动物源性传染病、无严重过敏史，开展感染性生物制品检查时需完成相应病原体的疫苗接种并确认抗体滴度合格。2.2环境与设施要求实验动物饲养与实验环境需符合GB14925-2010《实验动物环境及设施》的分级要求：使用普通级动物时，饲养环境温度控制在18℃~26℃，相对湿度40%~70%，日温差≤4℃，照度150lx~300lx，昼夜明暗交替周期为12h/12h，环境噪声≤60dB，换气次数≥8次/小时；使用SPF级及以上级别动物时，需在屏障环境或隔离环境中开展实验，屏障环境空气洁净度为7级（万级），动物饲养笼具处换气次数≥15次/小时，静压差≥10Pa，环境沉降菌平均菌落数≤3个/皿（Φ90mm，暴露30min）。开展感染性、毒素类生物制品检查时，需在符合BSL-2及以上级别的生物安全实验室中操作，配备二级生物安全柜、应急喷淋装置、职业暴露处置箱。实验废弃物（含动物尸体、垫料、耗材、剩余供试品）需经121℃高压灭菌30min或132℃高压灭菌15min处置后，交由具备资质的医疗废弃物处置单位统一处理，严禁未经灭菌处置的废弃物流出实验区域。3实验动物管理3.1种属与质量要求实验动物的种属、级别需严格按照待检产品项下的规定选择，无明确规定的优先选择SPF级小鼠，特殊产品可按要求选择豚鼠、大鼠、家兔或免疫缺陷动物。各品种动物的质量要求如下：（1）小鼠：周龄6~8周，体重18g~22g，同批次实验动物体重差异≤±2g，雌雄各半，每组雌性/雄性数量差≤1只；（2）豚鼠：周龄3~4周，体重250g~350g，同批次实验动物体重差异≤±30g，雌雄各半；（3）大鼠：周龄7~9周，体重150g~200g，同批次实验动物体重差异≤±20g，雌雄各半；（4）家兔：周龄4~6个月，体重1.8kg~2.2kg，同批次实验动物体重差异≤±0.2kg，雌雄各半；（5）免疫缺陷小鼠：如NOD/SCID、NSG小鼠，周龄6~10周，体重18g~25g，无免疫渗漏，需在隔离环境中饲养。所有实验动物需具备省级及以上实验动物质量监督检验部门出具的动物质量合格证明，无动物传染病、无外观畸形、无先天异常。3.2检疫与分组实验动物进入实验环境后需经历3天的检疫期，检疫期间每日观察2次，记录饮食、活动、被毛、粪便状态，检疫期内动物发病率/死亡率≥5%的，该批次动物不得用于实验，存在单个动物异常的需剔除后补入合格动物。实验分组需遵循随机原则，采用随机数字表法将动物分为供试品组、阴性对照组，存在特殊佐剂、载体的产品需增设佐剂对照组、载体对照组：每组小鼠不少于5只、豚鼠不少于4只、大鼠不少于3只、家兔不少于2只，对照组动物数量、种属、性别、体重分布与供试品组一致。4供试品准备与给药4.1供试品核验与储存接收供试品时需核对产品名称、批号、生产日期、有效期、生产单位、检验申请单编号、储运条件，确认供试品无浑浊、沉淀、变色、漏液、冻融（需低温储存的产品需确认冷链记录完整），不符合要求的供试品不得开展实验。供试品需严格按照产品说明书要求储存：2~8℃储存的产品放置于医用冷藏箱（温度波动≤±1℃），-20℃及以下储存的产品放置于低温冷冻箱（温度波动≤±2℃），避免反复冻融影响产品特性。4.2供试品稀释稀释液需按照待检产品项下的规定选择，无明确规定的采用灭菌生理盐水或pH7.2±0.2的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。稀释前需将供试品、稀释液平衡至室温（20℃~25℃），采用逐级稀释法配置，充分混匀避免产生气泡，稀释后供试品浓度的相对误差≤±5%。稀释后的供试品需在2h内使用，热敏性、不稳定供试品需现配现用。4.3给药操作给药剂量、给药途径需严格按照产品项下规定执行，无明确规定的按以下要求给药：（1）腹腔注射：小鼠每只给药0.5ml，豚鼠每只给药5.0ml，大鼠每只给药1.0ml，注射时针头与腹部皮肤呈45°角刺入，避免损伤肝、肠、膀胱等脏器；（2）静脉注射：小鼠每只给药0.5ml，豚鼠每只给药5.0ml，大鼠每只给药1.0ml，家兔每只给药10.0ml，注射速度控制为小鼠0.1ml/s、豚鼠0.5ml/s、大鼠0.2ml/s、家兔1.0ml/s，总注射时间不少于30s，确认针头完全刺入血管、回血顺畅后缓慢推注，注射部位无漏液、无肿胀。给药过程中出现操作失误（如漏液、针头脱出、注入部位错误）的动物需立即剔除，补充合格动物重新给药，剔除动物数量≥总实验动物数20%的，该批次实验无效，需重新开展。5观察与结果判定5.1观察周期与指标常规产品观察周期为7天，减毒活疫苗、细胞治疗产品、基因治疗产品、缓释制剂等需延长观察周期至14天~21天，具体按产品项下规定执行。观察期间每日至少开展2次（上午、下午各1次）指标记录，每日同一时间称量所有动物体重：（1）一般状态指标：饮食量、活动度、被毛状态、精神状态、呼吸频率、粪便性状、注射部位局部反应（红肿、硬结、坏死）；（2）特异性反应指标：神经症状（抽搐、麻痹、跛行、角弓反张）、过敏反应（抓鼻、兴奋、发绀、休克）、移植物抗宿主病（脱毛、弓背、腹泻、皮肤溃疡）、载体相关炎症反应（体温升高、水肿、器官肿大）；（3）解剖指标：实验过程中死亡的动物需在死亡后2h内完成解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器的病理变化，必要时开展组织病理检查确认死亡原因。5.2异常反应分级按照反应严重程度将动物异常反应分为3级：（1）轻度异常：仅出现被毛蓬松、活动减少、食欲下降，体重下降幅度≤10%，24h内完全恢复正常，无其他器质性损伤；（2）中度异常：体重下降幅度10%~20%，出现呼吸困难、跛行、注射部位硬结直径≤1cm，48h内可恢复正常，无不可逆损伤；（3）重度异常：体重下降幅度≥20%且持续72h未恢复，出现抽搐、麻痹、休克、濒死状态，或出现器官功能损伤、注射部位坏死。5.3结果判定规则5.3.1合格判定同时满足以下条件的判定为异常毒性检查合格：（1）供试品组所有动物健存，无重度异常反应，仅出现不超过1例轻度异常反应且24h内完全恢复；（2）供试品组动物体重增长趋势与阴性对照组无显著性差异（组间体重t检验P>0.05）；（3）解剖发现的死亡动物（若有）经确认是由非供试品因素（如动物先天疾病、操作损伤、饲养环境问题）导致。5.3.2不合格判定出现以下任意一种情况的判定为异常毒性检查不合格：（1）供试品组出现1例及以上动物死亡，且经解剖确认死亡与供试品毒性相关；（2）供试品组出现1例及以上重度异常反应，或2例及以上中度异常反应；（3）供试品组动物平均体重较对照组下降≥10%且持续72h未恢复，组间体重差异具有统计学意义（P<0.05）；（4）抗毒素、抗血清类产品出现1例及以上过敏性休克反应。5.3.3复试规则出现以下任意一种情况的需开展复试：（1）供试品组出现1例中度异常反应，48h内未完全恢复；（2）供试品组有1例动物死亡，但无法确认死亡原因是否与供试品相关；（3）阴性对照组出现异常反应，影响结果判定。复试时采用同一批次供试品，实验动物数量加倍（小鼠10只、豚鼠8只、大鼠6只、家兔4只），复试过程符合合格判定标准的判定为合格，出现任意不合格情形的判定为不合格。6特殊生物制品检查专项要求6.1疫苗类制品减毒活疫苗检查时需使用无对应病原体特异性抗体的实验动物，观察周期不少于14天，除常规指标外需监测特异性反应：如麻疹减毒活疫苗观察皮疹、体温升高情况，狂犬病减毒活疫苗观察神经症状。含铝佐剂的疫苗需增设铝佐剂对照组，注射部位出现直径≤1cm的硬结、7天内自行消退的，判定为佐剂导致的非特异性反应，不纳入异常毒性判定。6.2血液制品与抗毒素类制品人血白蛋白、静注人免疫球蛋白等血液制品检查时，需排除动物血清中异种蛋白交叉反应导致的假阳性，必要时开展被动皮肤过敏试验（PCA）辅助判定反应来源。马源抗毒素/抗血清类制品观察期内需重点监测过敏反应，出现即刻过敏性休克、肺水肿的直接判定为不合格。6.3重组生物制品重组单抗、重组细胞因子、重组激素等产品需重点监测免疫介导的延迟反应，观察周期不少于14天，必要时检测动物血清中抗药抗体（ADA）水平，ADA阳性且出现免疫相关损伤的判定为不合格。6.4细胞治疗产品CAR-T细胞、自然杀伤细胞、间充质干细胞等细胞治疗产品需使用免疫缺陷小鼠开展实验，优先选择静脉注射途径，观察周期不少于21天，每日开展移植物抗宿主病（GVHD）评分，评分≥2分（出现弓背、腹泻、脱毛等2种及以上症状）的判定为异常反应。6.5基因治疗产品腺病毒、AAV、溶瘤病毒等载体类基因治疗产品，观察期内需重点监测载体相关的炎症因子风暴，实验第3天、第7天检测血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，细胞因子水平较对照组升高≥5倍且出现相应炎症症状的判定为不合格。7质量控制与记录管理7.1实验系统质量控制每3个月开展1次实验系统有效性验证：采用0.5%卵清蛋白作为阳性对照物，按常规给药剂量注射入10只小鼠，24h内应至少出现8例轻度及以上异常反应，验证不通过的需排查环境、动物、操作问题，整改合格后方可继续开展实验。每年至少参加1次国家级生物制品异常毒性检查能力验证，验证结果需合格。7.2记录与报告管理所有实验操作需实时、如实记录，记录内容包括：供试品全信息、动物质量信息与分组情况、实验环境参数（温度、湿度、洁净度、压差）、稀释与给药操作全流程、每日观察指标与体重数据、异常反应描述与解剖结果、偏差处理情况、结果判定、检验人与复核人签字。实验原始记录需保存至产品有效期后1年，不少于5年，注册检验记录需永久保存。实验报告需明确标注供试品信息、实验方法、结果判定结论，复试项目需标注复试情况，报告需经检验人、复核人、签发人三级签字并加盖检验机构公章后方可生效。8生物安全与伦理要求8.1生物安全管理所有实验操作需符合《中华人民共和国生物安全法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》的要求，开展高致病性病原相关生物制品检查时，操作人员需穿戴三级防护装备，操作过程严格执行生物安全实验室操作规程，发生职业暴露时需立即启动应急预案，按规定流程处置并上报。8.2动物伦理管理异常毒性检查方案需经实验动物伦理委员会审查批准后方可实施，严格遵循“3R”原则（替代、减少、优化），在满足检验要求的前提下尽量减少动物使用数量。观察期内动物出现重度异常反应、濒死状态时需立即采取人道处死措施，处死方法符合美国兽医协会（AVMA）动物人道处死指南要求：小鼠采用颈椎脱位法或二氧化碳窒息法，豚鼠、大鼠、家兔采用二氧化碳窒息法或静脉注射过量戊巴比妥钠法，尽量减轻动物痛苦。9偏差处理与应急处置9.1偏差处理实验过程中出现偏差（如供试品稀释错误、给药剂量偏差≥10%、环境参数超标、对照组动物异常死亡）时，需立即停止实验，记录偏差发生的时间、原因、影响范围，由质量管理部门开展偏差评估：偏差不影响实验结果有效性的，可继续实验并在记录中备注；偏