酶的提取与分离纯化

酶工程姜静jing_jiang1974@QQ:1336754154生物制药教研室(A511)12酶蛋白制备分离选育构建表达发酵生产分离纯化产酶菌株发酵液酶制品知识回顾3

第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。纯化工艺评价

基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程6

第一节酶的分离一、发酵液预处理目的：提高固液分离效率使产物转移用于后处理相中去除部分杂质(一)发酵液的相对纯化1.无机离子的去除2.杂蛋白质的去除3.色素及其他物质的去除（降低离子强度、酶活性影响）（沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附）7(二）发酵液的固液分离1.影响发酵液过滤的因素

1）菌种2）培养基组成2.提高过滤性能的方法

1）絮凝和凝聚

2）稀释、加热

3）加助滤剂，常用硅藻土等。

主要方法是离心分离和过滤8二、细胞破碎（胞内酶）

（一）细胞壁组成

细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)

酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）

9微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成

10

细菌细胞壁的结构

酵母菌细胞壁的结构

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖

12（二）细胞破碎的方法

机械法机械捣碎法研磨破碎法匀浆破碎法高压匀浆法超声破碎法非机械法酶法化学法物理法干燥法131.机械法：

1）液体剪切：搅拌、匀浆。

2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。3）超声波破碎法。2.非机械法——物理法

1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。

2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。143.酶解法（enzymaticlysis）：

外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。

自溶法（autolysis）:

细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。154.化学法

应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。

1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

2）表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100，Tween等。16破菌

分离策略酶法+高压匀浆/超声盐及表面活性剂低浓度的变性剂DetergentIntactmembraneDetergentDetergent-solubilizedproteinsa17（三）细胞破碎确认

1.直接测定破碎前后的细胞数：

破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。

3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

18三、酶的提取(extraction)

把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

19

提取目标：

a.将目的酶最大限度地溶解出来。

b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。20提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。21

提取方法：（一）盐溶液提取

常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。

（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取22四、离心分离三种形式：1）离心沉降2）离心过滤3）离心分离和超离心

23（一）基本原理1.离心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2

N/60）2

N为离心机每分钟转数（r/min）；

Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字

g）表示。RCF=mr

（2

N/60）2/mg=1.12

10-5N2r

此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替

r平均=1/2（r大+r小）cm242.沉降系数:（sedimentationconstant）

指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于许多生物大分子的S值很小，所以定义10

13s

为一个沉降单位，1S=1

10

13s。

常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1~200之间。

25（二）离心机的种类按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速超速

26名称

转速(r/min)

注意事项

低速离心机

6000

常温，注意样品热变性和离心管平衡

高速离心机

6000〜25000冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡

超速离心机

>25000冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡

离心机的种类

27实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。28离心的形式角式及外摆式：外摆式一般为低速，

角式由低速到超速均有。29角式离心机和离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。30离心机的大小：落地式及台式31小台式离心机32离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖33离心机操作平衡、定温、定速、定时。34（三）常用离心方法

差速离心法

沉降速度法

密度梯度离心

沉降平衡法等密度梯度离心351．差速离心

（differentialcentrifugation）

采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。

2）沉降的颗粒受到挤压。36

差速离心分离示意图

（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况

37382．密度梯度离心

（densitygradientcentrifugation）

样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。39特点：区带内的液相介质密度小于样品物质

颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相

物质。40

密度梯度离心示意图

（a）离心前（b）离心后

41Densitygradientultracentrifugation42密度梯度离心

步骤：A.形成密度梯度B.加样C.离心D.收集样品433.等密度梯度离心

又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。44常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。45

等密度梯度离心示意图

（a）离心前；（b）离心后

46密度梯度离心等密度梯度离心分离依据分离物沉降系数不同分离物密度不同梯度样品操作通常用蔗糖，制备好梯度介质后加样通常用CsCl，样品与介质均匀混合后离心。离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度表观特点区带位置和宽度随离心时间不同而改变区带位置和宽度随离心时间不同而改变沉降速度离心和沉降平衡离心的特点4748（四）离心条件离心力:RCF=1.12

10-5N2r

离心时间:

t=K/S*(最高立离心速度/所需离心速度)2K=(lnr2-lnr1)/ω2==(lnr2-lnr1)×2.35×1011/n2温度和pH:49五、沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法50在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：

⑴中性盐沉淀（盐析法）

⑵有机溶剂沉淀

⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）

⑷等电点沉淀

⑸有机聚合物沉淀51（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1.基本原理（盐溶和盐析）

向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。52蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶53

原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。54蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域

5556571）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：

a.溶解度大

b.分离效果好

c.不易引起变性

d.价格便宜2.盐析用盐582)盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:

溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积593)调整盐浓度的方式

a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液60所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：

S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1——分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度61b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据

B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。62调整硫酸铵溶液饱和度计算表63盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。643.盐析曲线的制作

如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫铵饱和度％65

硫酸铵浓度（%）枯草杆菌

-淀粉酶发酵液的盐析曲线

664.盐析的影响因素1)离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：I：离子强度，I=∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）；

Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。

Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。

67

当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：

logS=β-KsI

两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。β分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。68692)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。70（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂丙酮

乙醇

甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。

713.优缺点：

优点：1）分辨率比盐析法高

2）沉淀不需脱盐

3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

724.影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度：低温（0℃）操作。（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度目的防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml73（三）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点

2.使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。743.优点：

1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内

2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低

3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化4.缺点：

酸化时，容易引起蛋白质失活

75（四）有机聚合物沉淀法

1.作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG

）多用分子量为6000～20000的PEG。3.优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。③沉淀后有机聚合物容易去除。76（五）选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。

⑴热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。

⑶有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。77六、萃取（extraction）分离

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：1）比化学沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快3）比蒸馏法能耗低

78（一）溶剂萃取法明确几个概念：料液：供提取的溶液。

溶质：料液中欲提取的物质。萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液。萃余液：被萃取出溶质后的料液。反萃取（backextraction）：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。

79溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律）为基础。在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。萃取相浓度C1分配系数K0=——————=——

萃余相浓度C2K0值随溶液pH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。80

普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，

因为:1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。

81萃取操作的3个步骤：

1）混合

2）分离

3）溶剂回收82（二）双水相萃取技术

又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）

用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

83优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。

84双水相的形成：

两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。

8586872.萃取原理：

利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。883.应用

胞内酶的提取和精制:

除去细胞碎片，并使酶得到纯化。

89

几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐

-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐90

双水相萃取法的重要研究方向

——亲和萃取（亲和分配）

使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。

91亲和萃取酶实例

蛋白质配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脱氢酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脱氢酶三嗪染料92（三）超临界流体萃取

兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体(supercriticalfluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。93（四）反胶团萃取1.反胶团：又称反胶束（ReversedMicelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。

反胶团模型亲水基团向内聚集94（正）胶束反胶束形成表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界胶束浓度。表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。构造表面活性剂极性基团在外，非极性基团在内，形成非极性核心。表面活性剂非极性基团在外，极性基团在内，形成极性核心，溶于水后，形成水池（waterpool）。功能溶解非极性物质溶解极性物质952.萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。96

反胶团萃取原理

973.表面活性剂及有机溶剂

反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。98（1）表面活性剂

常用：AOT(AerosolOT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。

（2）非极性有机溶剂环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。

994.优点1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。100酶的分离纯化破菌上清或沉淀离心加缓冲液破碎离心发酵菌体发酵液粗包涵体包涵体溶解液洗脱收集液包涵体完全洗脱液超滤透析加缓冲液离心加缓冲液重复洗涤加缓冲液离心加缓冲液上柱纯化沉淀粗纯化精纯化（制）盐析、有机溶剂、PI沉淀粗体溶解液洗脱收集液溶解上清完全洗脱液超滤透析加缓冲液离心加缓冲液溶解透析置换缓冲液加缓冲液上柱纯化上清分离101第二节酶的精制（精纯化）纯化原理（掌握）基本原则（掌握）纯化技术（掌握原理、选择依据）102纯化方法依据原理：

溶解度、特异性吸附、电荷、分子大小酶纯化的基本原则：①建立一个方便灵敏的分析方法(纯度、收率)；②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；③选择适宜温度，保持酶活性以避免酶的变性；④抗氧化失活（DTT,BME,EDTA,etc）；⑤其他添加剂，防止酶失活。第二节酶的精制（精纯化）103

酶精纯化常用技术膜分离技术柱层析技术蛋白质结晶透析超滤凝胶过滤（分子筛/排阻）层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析反相层析104一、膜分离

借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。105膜分离技术的分类扩散膜分离106（一）扩散膜分离

——透析（dialysis）溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动107

1.透析膜1）特点：①多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过；②化学惰性，多种溶液中不溶解；（材料：纤维素衍生物）③一定的机械强度；2）透析膜规格选择（表4.11-4.12）1082）透析膜的预处理：目的：除杂质。3）透析袋的保存：防腐剂＋冷藏。109蛋白质透析1102.透析方法及装置

透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图

1113.透析速度影响因素P164浓度梯度分子大小和形状温度膜表面积膜厚度112（二）超滤

依据被分离物质分子大小、形状和性质的不同，在外力作用下形成一定压力差，使溶液中物质在超滤膜表面发生分离，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。1131.超滤膜特点非对称双膜结构，包括分离层和支撑层。超滤膜性能指标包括渗透通量和截留率。1142.超滤装置——实验室装置115根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：截留颗粒直径操作压力应用微滤0.2~2m<0.1MPa除菌超滤20A~0.2m0.1~0.7MPa分离病毒及生物大分子116微滤(Microfiltration，MF)

一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；117常规过滤(A)和超滤(B)的示意图

AB1181192.超滤装置——工业装置中空纤维系统120超滤膜包装置2.超滤装置——工业装置1213.超滤膜的选择及使用截留分子量流速材质膜完整性清洗与保存4.影响流速的因素溶质分子性质溶质浓度压力搅拌温度其他122色谱起源色谱组分色素石油醚碳酸钙颗粒

用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。（二）柱层析技术123ColumnChromatography124

层析柱的制备与层析操作

柱层析的设备:

层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。125层析设备层析装置：

梯度混和器

蠕动泵

层析柱

监测仪

记录仪

收集器

126记录仪127低温层析柜128129现代化层析设备

——AKTA层析柱XKBPG130现代化层析设备——AKTA131记录系统132良好的线性放大133(一)凝胶过滤层析

凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析（molecularsievechromatography）、排阻层析（exclusionchromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。134（1）.基本原理

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。135136137Size-exclusionchromatography138凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）139凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅲ.其它组分0<Kd<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。140

分配系数Kd的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，

Kd差异小，分离效果差。141（2）.凝胶的种类和性质

1)交联葡聚糖凝胶（dextrangel)

商品名:Sephadex

型号

SephadexG－10至G-200

G后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。142凝胶型号

颗粒大小/μm

溶胀体积/(ml/g)

分离范围（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

葡聚糖凝胶层析介质的有关参数

1432）琼脂糖凝胶（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;

Bio-GelA(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。1443）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）

商品名为Bio-Gel,型号从Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。145146（3）

操作：1）凝胶的选择和处理根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。1473）加样体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。4）洗脱洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。1481494.应用

1）脱盐２)生物大分子物质的分离纯化

3）分子量的测定

4）溶液浓缩150（二）离子交换层析

（ionexchangechromatography，IEC）1512.离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

纤维素琼脂糖葡聚糖

载体电荷基团—O—CH2—COO-—Na+反离子1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。152离子交换剂--带有电荷基团的不溶性载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体Diethylaminoethyl(DEAE)

阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)

阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)153两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3154

化学原料合成：树脂类物质载体

天然材料制成：cellulosesephadexsepharose

阳离子交换剂:电荷基团（－）,反离子（＋）电荷基团阴离子交换剂:电荷基团（＋）,反离子（－）

如：DEAE-Sepharose，CM-Sepharose155

离子交换葡聚糖

以SephadexG-25,G-50为骨架，接入离子交换基团。

DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion阴离子

C:cation阳离子156

离子交换剂的选择a.强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广弱型：适用的pH范围窄b.阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若<pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂1572）蛋白质的电荷性质41214268100系统pH+

蛋白质带正电荷

蛋白质带负电荷等电点-pH值如何影响蛋白质的电荷数158

实验设计原理利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。pH6.0pI>6.0蛋白质带正电pI<6.0蛋白质带负电1592.阴离子交换剂分离蛋白质的过程平衡吸附去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-160Ion-exchangechromatography1613.操作平衡上样平衡洗脱再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:

增加溶液的离子强度

梯度洗脱法

改变溶液的pH值

3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。4.应用制备纯化生物大分子162图4-39梯度溶液的制备方法和洗脱曲线（a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度163影响离子交换层析的主要因素PH离子强度层析介质（流速、分辨率）164（三）疏水层析（HydrophobicInteraction

Chromatography,HIC）从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。165

大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobicpatch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。原理:166

在高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。1671682.吸附剂

亲水性（如Sepharose）基质固定相疏水性（如硅胶、树脂）配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）169产品名称载体配基生产公司PhenylSepharose4FF琼脂糖凝胶珠苯基GEOctylSepharose4FF琼脂糖凝胶珠辛基GEButylsepharose4FF琼脂糖凝胶珠丁基GE

一些商品疏水层析介质

1703.操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或

8mol/L脲素溶液。4.应用主要用于分离纯化大分子物质。171（四）吸附层析（adsorptionchromatography）

1.原理利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。172173吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。1742.吸附剂

吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭1752）吸附剂的性质：活性炭：强吸附介质，选择性差，除色素。硅胶：常用的极性吸附介质，有机小分子吸附。羟基磷灰石（HA）

[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。

分离纯化生物大分子：DNA（不高于10ng/人剂量），Protein176

（五）亲和层析(AffinityChromatography)

由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（functionchromatography）生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）1771.原理及特点

（1）原理：将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一分子进行纯化。

（2）亲和层析特点分辨率高分离速度快操作简单对设备要求不高亲和吸附剂通用性差洗脱条件苛刻178+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附179Affinitychromatography1802.基质的选择理想的基质应满足以下要求：①高度的亲水性。②极低的非特异性吸附性（惰性）。③具有足够的化学基团。④适当的多孔性。⑤较好的理化稳定性。181可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B1823.配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。

优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。183所要分离的目的产物

相应的配基

酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白

目的产物与相应的配基

184当前常用亲和吸附介质的配基酶底物（GST-GS）抗体（针对特定抗原）金属离子（Ni-NTA）ProteinA（吸附Ig的Fc部位）1854.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。186溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基1872）引入连接臂（spacearm）

又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B188189常用手臂1905.操作：1）层析前：选择亲和层析剂

选择根据欲分离物质特性配基选择根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱偶联亲和层析剂191非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与配体结合1926.应用1）纯化带“标签（tag）”蛋白如：带有His-tag，GST-tag蛋白纯化2)抗体及Fc融合蛋白纯化ProteinA193(六)反相层析——高效（压）液相层析（HPLC常用于分析）反相层析原理：同疏水层析，常用于高效液相层析特点：①使用的固相支持剂颗粒很细（<5um），表面积很大,因而分辨率很高。②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。固定相（柱填料）：常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。194

反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。即：随着甲醇梯度的增加而洗脱出疏水性越来越强的蛋白质。1951.HPLC原理

HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。1962.分类

按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类：离子交换色谱（IEX-HPLC）：——离子交换能力凝胶色谱（SEC-HPLC）：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱：——分配系数197分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。

固定相：硅胶填料是非极性的，官能团为烷烃。

流动相组成：常用“甲醇—H2O”。

1983.色谱仪组成

1）进样系统

2）输液系统

3）分离系统

4）检测系统

5）数据处理系统199PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase200第三节酶蛋白常用的纯度分析技术——电泳

电泳（electrophoresis,EP）：

指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。201一、电泳的基本理论

1.原理:

在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+-202

2.关键术语：迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性203

影响迁移率的因素：1）颗粒性质：

Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：

pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。原因：离子氛（ionicatmosphere）。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。204区带电泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。界面电泳：又称移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类205按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。

206③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。207

3.电泳常用设备

（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。

常压电泳仪（600V）

高压电泳仪（3000V）

超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：

自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：

208水平板式电泳槽垂直板式电泳槽209二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。

2101.原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺212

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED

催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）

引发剂:光

TEMED的存在，可加速聚合。.213聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成214

凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。

T=

C=

凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。

Acr与Bis的重量比应在30左右。

凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%215样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2162.分离效应

PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应

连续PAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

218三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。219

SDSseparatesproteinsbyMW2201.原理?

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。221

蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。2222232242.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:

（变性：buffer中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：

Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。2252）样品制备：

a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）

b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：

SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。2264）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：

考马斯亮蓝染色法

银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。227电泳胶实例228四、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。2291.原理

两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。230两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。231等电聚焦电泳2322.操作：

1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%

左右）

2）加样：任意位置

2333）电泳：阳极：磷酸溶液电极溶液阴极：NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。2345）等电点测定：

Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI235第四节

酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩

(一)蒸发浓缩

图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶236（二）

超滤浓缩

超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61

酶的超滤浓缩

237（三）吸水剂

1.胶过滤浓缩：

利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。2382.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。

利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。239（四）反复冻融浓缩

利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。

（五）沉淀法盐析法，有机溶剂法240二、酶的干燥

酶的干燥多采用冷冻干燥法。

将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。

241三、酶的结晶

结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。

242

晶体沉淀——分子排列有规则蛋白质沉淀

非晶体沉淀——分子排列无规则（无定形沉淀）