ISO 15213-22023 食物链微生物学梭菌属检测和计数的水平方法第2部分菌落计数技术对产气荚膜梭菌的计数标准立项发展报告

食物链微生物学梭菌属检测和计数的水平方法第2部分：菌落计数技术对产气荚膜梭菌的计数标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodforthedetectionandenumerationofClostridiumspp.—Part2:EnumerationofClostridiumperfringensbycolony-counttechnique(ISO15213-2:2023)摘要产气荚膜梭菌（*Clostridiumperfringens*）作为引发食源性疾病的重点病原微生物之一，其检测与计数的标准化水平直接关系到食品安全风险监测的科学性和国际互认度。本报告围绕国际标准化组织（ISO）发布的ISO15213-2:2023《食物链微生物学梭菌属检测和计数的水平方法第2部分：菌落计数技术对产气荚膜梭菌的计数》展开系统分析，从标准立项背景出发，深入探讨了产气荚膜梭菌对人类健康的威胁及其检测标准化的紧迫性。报告重点解析了该标准的技术框架，包括以胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂为基础的选择性培养基配方、双层琼脂浇注法的操作流程、典型菌落的确认鉴定程序和结果计数与报告规则，并对标准中引入的质量控制要求、方法性能指标及实验设备与试剂规格进行了详细说明。在此基础上，报告展望了分子生物学检测技术与传统培养法相互融合的发展趋势，以及国际标准向国内标准转化的路径与策略，为相关检验机构和食品生产企业正确理解和有效实施该标准提供了专业参考。关键词：产气荚膜梭菌；菌落计数技术；食品微生物检验；水平方法；国际标准Keywords:Clostridiumperfringens;Colony-counttechnique;Foodmicrobiology;Horizontalmethod;Internationalstandard一、引言食品安全是关系国计民生的重大课题，微生物污染作为引发食源性疾病的首要因素，其精准检测与有效控制一直是全球食品安全监管体系的核心环节。在众多食源性病原微生物中，产气荚膜梭菌（*Clostridiumperfringens*）因其广泛的分布特性、较强的环境耐受能力以及明确的致病机制，已被世界卫生组织列为食源性疾病的重点监测对象。据全球疾病负担研究（GBD）数据估算，产气荚膜梭菌引起的食源性疾病每年影响数十万人，对食品工业和公共卫生体系构成了显著威胁。在此背景下，国际标准化组织（ISO）依据其食品微生物学标准体系框架，于2023年11月发布了ISO15213-2:2023。该标准作为ISO15213系列标准的组成部分，专门针对产气荚膜梭菌的菌落计数方法制定了统一的技术规范，致力于在全球范围内建立起分析结果的可比性和互认机制。食品微生物学检验的国际标准化，不仅关乎检测数据的科学性与可靠性，更直接影响国际贸易中食品安全的信任传递。本报告对该标准进行全面的立项发展分析，旨在厘清其技术逻辑与应用要点，为各利益相关方提供系统性参考。二、立项背景2.1产气荚膜梭菌的生物学特性与危害产气荚膜梭菌为革兰氏阳性、厌氧性芽孢杆菌，广泛存在于土壤、水、灰尘、食品原料以及人和动物的肠道中。该菌在适宜条件下可迅速繁殖，其致病性主要源于所产生的多种毒素，其中A型菌株产生的α毒素和F型菌株产生的肠毒素（CPE）是导致食物中毒的关键因子。临床上，产气荚膜梭菌感染通常表现为急性胃肠炎，潜伏期约6—24小时，主要症状包括腹痛、腹泻、恶心等，病程一般较短，但对免疫力低下人群、老年人和儿童可能造成严重并发症。从食品安全角度来看，肉类和禽类产品是产气荚膜梭菌污染的高风险食品类别。餐饮服务中大量制备和保温不当是导致产气荚膜梭菌食物中毒爆发的典型场景。当食品在10—54.4℃的温度区间内长时间存放时，该菌可快速增殖至致病剂量（通常认为超过10⁶CFU/g），从而引发食物中毒事件。因此，对食品中产气荚膜梭菌进行准确、可靠的定量检测，是评估食品加工卫生状况、验证关键控制点（CCP）有效性以及开展食品安全风险监测的基础技术支撑。2.2国际标准制定的紧迫性尽管产气荚膜梭菌的检测方法已在多个国家和地区建立了国家标准或行业规范，但这些方法在培养基组分、培养条件、确认试验流程以及结果表达方式等方面存在显著差异，导致不同实验室、不同国家之间的检测结果缺乏可比性。在国际食品贸易日益频繁的今天，这种方法学上的不一致已成为技术性贸易壁垒的潜在来源，也对跨国食品安全事件的溯源调查造成了技术障碍。ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）作为食品微生物检验方法国际标准的归口技术组织，长期致力于制定和协调食品链微生物检验的水平方法。所谓“水平方法”，是指适用于各类食品基质、各类微生物靶标检测的通用性技术规范，其优势在于为实验室提供统一的技术基准，减少因方法差异引入的系统误差。ISO15213-2:2023正是在这一标准化理念指导下，对原有ISO15213:2003进行结构性拆分和修订后形成的系列标准之一。2.3ISO15213系列标准的框架演进-ISO15213-1:2023规定了梭菌属（*Clostridium*spp.）检测的水平方法；-ISO15213-2:2023专门规定了产气荚膜梭菌的菌落计数方法，即本报告所聚焦的标准；-系列中其他部分则针对不同目标菌种和不同检测原理逐步扩展。这种“总—分”结构的标准框架，既保证了各标准在术语定义、通用要求方面的一致性和协调性，又为不同目标菌种的技术细节提供了充分的针对性表述空间，体现了国际标准体系设计中的科学性和前瞻性。三、标准主要内容ISO15213-2:2023在技术路线上采用经典的平板菌落计数原理，结合选择性培养基和确证试验，实现对食品中产气荚膜梭菌的定量检测。以下为该标准核心内容的技术解析。3.1适用范围与核心术语ISO15213-2:2023明确规定其适用于人类消费用食品和动物饲料中产气荚膜梭菌的计数，同时也适用于食品生产环境样品（如表面拭子）的检测。该标准确立了其“水平方法”地位，即该方法广泛适用于各类食品基质，而不局限于某一特定食品类别。这一设计理念确保了检测结果在不同类型样品之间的可比性，也为实验室方法验证和能力验证活动提供了统一依据。标准替代了ISO15213:2003中与产气荚膜梭菌计数相关的内容。原标准中涉及梭菌属检测的通用方法由ISO15213-1承担，形成了各司其职、互为补充的标准体系。在术语定义方面，标准沿用了ISO16140系列和ISO7218等基础标准中确立的框架性术语，同时根据产气荚膜梭菌检测的特殊性对相关术语进行了明确界定。标准对“产气荚膜梭菌计数”给出了精确定义，即“在特定培养条件下，通过菌落计数并经过确证试验后计算得到的每克或每毫升样品中产气荚膜梭菌的数量”，这一定义兼顾了方法学的可操作性和结果表达的科学性。3.2培养基与试剂培养基的性能直接决定了选择性计数的准确性。ISO15213-2:2023采用胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TryptoseSulfiteCycloserine，TSC）琼脂作为选择性分离培养基。TSC培养基的核心设计逻辑在于利用亚硫酸盐-铁离子体系实现目标菌落的可视化区分，同时借助D-环丝氨酸有效抑制多数革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌的生长干扰。此外，标准还规定了稀释液的选择原则。根据样品类型的不同，可使用蛋白胨盐稀释液、缓冲蛋白胨水或生理盐水等，相关要求遵循ISO6887系列标准的通用规定。对于某些特殊基质（如高脂肪含量食品或高酸性食品），标准允许在稀释液中添加适量吐温80（Tween80）或适当调节pH值，以提高目标菌的回收率。这种灵活性设计既保证了方法的标准化属性，又兼顾了实际样品处理中基质多样性的客观需求。3.3菌落计数操作流程ISO15213-2:2023规定的操作流程遵循经典的双层浇注法（pourplatetechnique），其核心步骤可分为样品制备、接种培养、菌落确认和结果计数四个环节。（一）样品制备与稀释依据ISO6887-1的通用要求，待检样品在无菌条件下取代表性部分，加入适宜稀释液进行均质处理。对于肉类等高蛋白基质，推荐使用拍击式均质器处理1—2分钟以确保微生物充分分散。随后按照十进制梯度进行系列稀释，每个稀释度应新鲜配制并严格控制操作时间，避免目标菌因环境暴露而失活或过度增殖。标准要求在30分钟内完成从样品制备到接种的全过程，以减少计数偏差。（二）接种与培养取1mL适宜稀释度的样品悬液加入无菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却至44—47℃的TSC琼脂，立即轻轻旋转平皿使样品与培养基充分混匀。待底层琼脂凝固后，再倾注约10mL覆盖层TSC琼脂以确保厌氧环境的形成。充分凝固后，将平皿置于厌氧培养装置中，在37℃±1℃条件下培养20±2小时。厌氧条件的建立是该方法的操作要点之一。标准允许使用厌氧罐、厌氧手套箱或产气袋系统实现厌氧环境，并要求通过厌氧指示剂验证培养过程中的厌氧状态。培养结束后，典型产气荚膜梭菌菌落呈黑色或暗灰色，直径约0.5—2.0mm，周围可观察到黑色沉淀圈，这是亚硫酸盐还原为硫化物并与铁离子反应形成黑色沉淀的结果。（三）确证试验虽然不是所有黑色菌落均为产气荚膜梭菌（其他梭菌或某些芽孢杆菌也可能呈现类似反应），标准规定对典型菌落需进行确证试验。标准推荐的确证程序包括：一是从计数平皿中挑取至少5个典型菌落进行纯化培养；二是对纯培养物进行革兰氏染色镜检（应为革兰氏阳性杆菌）；三是检测硝酸盐还原能力（产气荚膜梭菌为阳性）；四是验证运动性（产气荚膜梭菌通常为非运动性）；五是检测乳糖发酵和明胶液化等生化特征。通过综合生化特征判定确证阳性菌落数，并以此校正原始计数结果。（四）结果计算与报告标准采用经典的菌落计数公式进行计算，根据确证阳性菌落比例校正后，乘以相应的稀释倍数，得出每克或每毫升样品中的产气荚膜梭菌数量（以CFU/g或CFU/mL表示）。计数结果报告规则遵循ISO7218中规定的通用原则，包括计数范围的选择（通常以含15—300个菌落的平皿为有效计数区间）、检测限的计算方式（基于最低检测稀释度和接种量的函数）以及结果修约规则。当未检出目标菌时，报告结果应表述为“<1×最低稀释倍数的倒数”或根据实际检测限报告为“<检测限”。3.4方法性能与质量控制ISO15213-2:2023的一大亮点在于对方法性能指标和质量控制提出了明确要求。标准规定，实验室在首次采用该方法时应进行方法验证，验证参数至少包括灵敏度、特异性、检出限、定量限和重复性等关键指标。实验室需根据验证结果确认其在自身的实验条件下能够达到方法预期的性能水平。在日常检测中，标准要求实验室必须实施严格的内部质量控制程序，包括：每批次测试使用参考菌株（如*C.perfringens*ATCC13124或其他等效菌株）作为阳性对照，以验证培养基和培养条件的有效性；使用已知不含有目标菌的样品作为阴性对照，以排除交叉污染的可能性；平行样品的相对标准偏差应满足方法规定的重复性限要求。这些质量控制措施的实施不仅保障了检测结果的可信度，也增强了实验室间结果的可比性，为实验室认可和能力验证活动提供了统一的技术评价依据。四、主要起草单位与产业参与ISO15213-2:2023的制定凝聚了国际食品微生物学领域众多权威机构和专家的集体智慧。标准制定工作由ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）归口管理，多国标准化机构深度参与了标准的起草与审查。在标准制定过程中，来自各国政府实验室、学术研究机构、第三方检测机构和食品产业界的专家共同组成了工作组（WG），围绕培养基的选择性验证、厌氧培养条件的最优化以及不同食品基质的适用性等关键技术问题开展了多轮联合试验研究，为标准技术指标的确定提供了充分的实验数据支撑。在各参与机构中，法国食品安全局（Anses）下属的食品安全实验室作为该项标准制定的重要技术支撑单位，凭借其在厌氧菌检测领域长期积累的研究经验和国际公认的技术权威性，为标准的起草提供了关键性技术贡献。该实验室在产气荚膜梭菌的生理代谢特征研究、选择性培养基性能评估以及食品基质中梭菌检测方法的协同试验等方面拥有深厚的科研积累，其研究成果被直接转化为标准中多项技术条款的设计依据。此外，德国联邦风险评估研究所（BfR）、美国食品药品监督管理局（FDA）等机构的专家也在标准审查阶段提出了重要的技术建议，为标准技术的完善和方法的国际适用性提升发挥了积极作用。在产业界方面，全球多家食品微生物检测试剂和培养基生产商为标准的制定提供了丰富的产品性能数据，推动了标准中培养基质量验收指标的合理化设置。各国食品安全监管机构和第三方检测实验室则通过参与国际协同试验（collaborativestudy），为标准方法精密度数据的确定以及重复性限和再现性限等技术指标的设定贡献了关键的实验室间验证数据，确保了标准规定的性能指标具有充分的数据支撑和工程可信度。五、发展趋势与展望5.1分子生物学方法的融合趋势近年来，聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）以及基于基因组测序的新型检测技术在食品微生物学领域快速发展，为产气荚膜梭菌等厌氧菌的检测提供了更为快速和灵敏的技术手段。然而，ISO15213-2:2023所确立的传统培养计数法在定量准确性、活菌选择性以及法规符合性方面仍具有不可替代的优势。当前国际标准发展的总体趋势并非以分子方法完全取代传统培养法，而是推动两种方法体系的互补融合——即在保留培养计数法作为基准方法（referencemethod）地位的同时，针对快速筛查场景制定分子方法的补充标准。这种“双轨并行”的标准化策略既满足了日常监管对检测时效的需求，也保障了法律争议场景下仲裁方法的技术权威性。5.2国际标准向国内标准的转化对于我国而言，ISO15213-2:2023的发布为国内相关标准的修订和完善提供了重要的技术参考。我国现行食品安全国家标准GB4789.13—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》在方法原理上与ISO标准同源，但在培养基配方细节、培养条件选择和确证试验流程等方面存在一定差异。未来，随着我国食品安全标准体系与国际标准接轨程度的不断深化，借鉴ISO15213-2:2023的技术框架，推动国内标准的同步修订与验证，将成为提升我国食品微生物检验水平、促进食品国际贸易畅通的重要举措。5.3面向未来的标准化方向展