应用微生物-绪论

应用微生物主要内容教材的选用注意事项（平时、考试）绪论刘爱民编著

微生物资源与应用东南大学出版社

2008年6月第一版李莉.应用微生物学，武汉理工大学出版社，2006。吴剑波主编，张致平副主编.微生物制药.化学工业出版社，2003年12月第一版教学目标了解微生物应用的现状、发展趋势了解应用微生物学的主要研究方法，掌握两种以上实用技术熟悉微生物应用的主要途径，具备基本的研发思路主要教学内容绪论4学时微生物肥料3学时微生物农药3学时微生物食品（食用菌）6学时微生物医药6学时微生物环境治理4学时微生物能源2学时复习2学时其它关键事项多媒体教学为主；视频与动手操作相结合；平时考核(50%)：考勤20%、随堂考试20%；实际操作10%期末考试(50%)：开卷考试（第17周）。第一章

绪论一、微生物资源的定义微生物资源是指微生物本身的资源，如真菌、细菌、放线菌等能发酵产生生理活性物质，包括真菌多糖、维生素、低聚糖、活性油脂、氨基酸、酶制剂、抗菌素等菌体或代谢产物；以及微生物发酵所产生的下脚料——废渣、废水等。

微生物对维持生态平衡起重要作用广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各领域微生物是重要的可再生生物资源据粗略估计，全世界目前微生物产业的年产值达2000亿美元，每年由微生物向全球药业市场提供的原材料就达500亿美元；在日本，发酵行业的年产值与电气和电子行业相当。第一节微生物的种类与分布关于微生物微生物是天然资源的公共意识远未建立微生物形体小，代谢类型及其多样化，生长繁殖速度惊人种源丰富，未知者众微生物的变异性大微生物资源的开发潜力大，生产性能优越，前景广阔。固体基质发酵的典型例子例子基质参与的微生物食用菌生产秸秆、畜禽粪便双孢蘑菇(Agaricus

bisporus)香菇(Lentinus

edodes)草菇(Volvariella

volvacea)泡菜生产卷心菜、萝卜等乳酸细菌酱油生产大豆和小麦米曲霉(Aspergillus

oryzae)奶酪生产凝乳娄地青霉(Penicillium

roquefortii)浸矿低品位矿石硫杆菌（Thilbacillussp.)有机酸生产蔗糖、糖蜜黑曲霉（Aspergillus

niger）酶生产麦麸等黑曲霉（Aspergillus

niger）堆肥混合有机物细菌、真菌、放线菌废水生产废水成分细菌、真菌、原生动物微生物资源的特性物种多样性代谢类型多样性生态系统多样性生活方式的多样性遗传多样性

（一）物种多样性

生物多样性(biodiversity)是生物及其与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，它包括数以千百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以及它们与生存环境形成的复杂的生态系统。地球上不同类群的微生物资源类群已知种估计种已知种占的比例%病毒5000130，0004细菌47604000012真菌6900015000005藻类400006000067各国微生物种株保有数国别微生物种株保有数DNA解析比例%美国约7100060欧洲约6400030日本约800010（二）代谢类型多样性不可比拟的微生物的代谢多样性

原核生物具有多种多样的代谢类型和生理功能，可适应各种生态环境并以不同的生活方式与其他生物相互作用，构成了丰富多彩的生态体系。细菌在能量利用和物质循环上具有多种代谢类型；既能利用太阳能又能利用化学能，代谢中产生的电子受体可以是有机物也可以为无机物，代谢的环境可以有氧也可无氧。细菌的营养代谢类型及代表营养类型好氧厌氧无机营养有机营养无机营养有机营养光能营养蓝绿细菌无绿硫杆菌红细菌化能营养亚硝化单胞菌假单胞菌硫小杆菌梭菌1.物质转化具有多种多样的途径碳的分解代谢有多种途径：EMP途径、HMP途径、ED途径和WD途径和葡萄糖直接氧化途径。氮代谢类型多种多样：自生固氮、共生固氮代谢产物的产生途径的多样性细菌在生长发育过程中可产生或分泌多种物质同一微生物因环境变化可改变代谢类型2.细菌的适应多样性几乎在任何环境条件下均可生活

通过适应性不同的单细胞群体形成能耐受和适应各种特殊环境的细菌种群来适应不同的生态环境。强酸、强碱、高盐、高温、低温、高压等极端环境下，细菌均可生长；厌氧呼吸更是微生物所特有的功能。3.微生物对物质的降解几乎万能不含氮有机物：纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶物质等含氮有机物：蛋白质、甲壳质、尿素等

微生物在维持各种自然生境的物质转化上具有其它生物无法替代的作用。4.代谢产物的多种多样微生物代谢产物有300多种，已知的有37大类，已大量生产的才近百种。微生物酶有几千种，但实际应用的仅几十种。微生物代谢产物的应用产业微生物代谢产物医药抗生素，药理活性物质，维生素，抗肿瘤剂，基因工程药物，疫苗等食品氨基酸，鲜味增强剂，脂肪酸，蛋白质，糖与多糖类，发酵剂，脂类，核酸，核苷酸，核苷，维生素，饮料等农业动物生长促进剂，除草剂，植物生长促进剂，灭害剂，驱虫剂，杀虫剂等轻工酸味剂，生物碱，酶抑制剂，酶，溶媒，辅酶，表面活性剂，转甾醇和甾体，有机酸，乳化剂，色素，抗氧化剂，石油等其它离子载体，抗代谢剂，铁运载因子等按工业领域划分的发酵产品领域产品/活性化学品

有机的（批量的）乙醇、丙酮、丁醇、有机酸（柠檬酸、衣康酸）

有机的（精细的）酶、香料、多聚物(主要是多聚糖）无机物生物选矿、生物富集、生物浸矿(铜、铀)医药用品抗生素，诊断试剂(酶、单克隆抗体)，酶抑制剂，类固醇，疫苗能源燃料乙醇，甲烷(沼气），生物质食品奶制品(奶酪、酸奶、鱼和肉制品），饮料（酒精饮料、茶、咖啡）、面包酵母、食品添加剂(抗氧化剂、色素、香料、稳定剂），新食品(酱油、面酱）、食药用菌、氨基酸，维生素，淀粉制品，葡萄糖和高果糖糖浆，功能改良的蛋白质和果胶农业用品动物饲料(单细胞蛋白)，动物疫苗，青贮饲料和堆肥，微生物杀虫剂，根瘤菌等固氮细菌接种物，菌根菌接种物5.控制微生物代谢的目的获得微生物菌体积累低分子代谢产物：抗生素、有机酸等生产特异性生物大分子：酶等分解和转化工农业废弃物（三）生态系统多样性地球上每一角落都是不同的微生物生态系统(即使在很小的范围也可能存在多个微生物系统）。陆生(土壤)微生物生态系统水生微生物生态系统大气微生物生态系统根系微生物生态系统极端环境微生物生态系统活性污泥微生物生态系统“生物膜”微生物生态系统人体的微生物生态系统陆生(土壤)微生物生态系统土壤素有“微生物天然培养基”之称，土壤中微生物种类最多，数量最大，是最主要的微生物资源库。对土壤的形成、土壤肥力、生物质的生产、对含C、N、S、P等元素的有机物的矿化都有非常重要的作用。土壤是微生物的天然培养基土壤是微生物的大本营,一克沃土中含菌量高达几亿甚至几十亿;土壤中微生物的种类繁多,几乎所有的微生物都能从土壤中分离筛选得到,目前应用的微生物产品,多数是从土壤分离得来。

从土壤分离微生物的操作过程水生微生物生态系统水是很好的溶剂。水生微生物生态系统可分为淡水水生微生物生态系统和海水水生微生物生态系统。水中的异养微生物可把腐殖质、有机废弃物等分解并部分转化为微生物蛋白；水中的光合微生物(如光合细菌、蓝细菌、藻类等）通过光合作用，将无机物转化为有机物而合成自身细胞物质。71％的地球表面为水所覆盖。地球是行星中唯一一颗能在表面存在有液态水，而液态水是生命存在的重要条件。大气微生物生态系统大气中含C量极低，不是微生物生长繁殖的适宜环境，无固定微生物种群。许多微生物可以休眠体适应不良环境。大气微生物主要为细菌、真菌，附着在尘埃、小水滴及动物呼吸排泄物等。研究其传播途径、规律及其变化，对研究大气污染，防止有害微生物特别是流行性病原菌对动植物和人类造成大范围损伤，具有及其重要的理论和实践意义。根系微生物生态系统维系植物的正常生理功能共生关系：固氮菌与豆科植物菌根菌：大豆根瘤菌

极端环境微生物生态系统极端环境包括高温、低温、高盐、强酸、强碱、高压等环境。在蛋白质和核酸组成、分子结构、细胞膜分子结构和功能、酶的结构和性质及代谢途径等方面，发生了生理性和进化性的改变。其研究有助于了解极端环境因子对微生物种群、群落分布、生理功能等的作用规律，对研究微生物分类、生物进化甚至生命起源。应用其特殊基因、特殊功能的酶（耐热酶、耐碱酶等）、开发新的生物产品等。活性污泥微生物生态系统活性污泥法是以活性污泥为主体的废水生物处理的主要方法，是向废水中连续通入空气，经一定时间后因好氧性微生物繁殖而形成的污泥状絮凝物。活性污泥上栖息着以菌胶团为主的微生物群，具有很强的吸附与氧化有机物的能力。颜色呈黄褐色，有大量微生物组成，易于与水分离，能使污水得到净化，澄清的絮凝体。组成：G+，G-，丝状真菌、原生动物、后生动物、有机残片、无极颗粒、胶体等组成的结构复杂的共生体系。生物膜微生物生态系统生物膜是由各种微生物种群构成的特殊的微生物生态系统。至少有两层结构：外层——好氧异养微生物种群，降解各种有机污染物；内层——各种兼性厌氧或厌氧的化能异养或化能自养微生物种群，进行各种氧化还原反应，特别是硫酸盐还原和反硝化作用。人体的微生物生态系统在人体体表及体内存在大量微生物。皮肤表面有10万个/cm2，口腔细菌超过500种，肠道微生物总量可达100万亿。地球上每一角落都是不同的微生物生态系统，即使是同一地点、同一环境，在不同的季节，微生物的数量、种类、活性、生物链成员的组成等也会有明显的不同。自然界的微生物受环境因素的影响，温度、湿度、酸度、营养、空气都会极大地影响微生物的生存。空气、雨水、动植物、人、机械等都可以传播微生物，在人类活动频繁的场所，微生物群落的变化比较大。（四）生活方式的多样性微生物同其它生物间的关系也因种群而异，它们可通过代谢活动为其他生物提供营养，也可对它们的生命活动有所抑制甚至致死。微生物对其他生物的依赖关系可以分为腐生、互生、共生和寄生。微生物可产生多种生物活性物质，如各种抗菌素、细菌素及短肽，而对其他菌群抑制（即拮抗作用）。不同生态系统中微生物与其它生物的相互关系关系微生物种群其它生物体、部位功能作用腐生肠杆菌、芽孢菌代谢物质或尸体分解代谢互生拟杆菌、乳酸菌成团肠杆菌厌氧产酸细菌动物肠道水稻体内甲烷菌抑制肠道病原、提高酶、维生素可能固氮降解脂肪酸产甲烷共生根瘤菌内共生体菌根菌豆科植物根瘤舌蝇中肠表皮细胞兰科植物共生固氮提供维生素B保证寄主产卵力帮助植物吸取营养寄生蛭弧菌立克次氏体黄单胞菌锈菌革兰氏阴性细菌人细胞内植物体植物体使寄主致死寄主的斑疹伤寒多种植物病害锈病（五）遗传多样性基因组大小和基因数目的多样性

原核生物基因组大小：0.6~9.45Mb

不同种类、菌株、血清型，基因数目与组合有较大差异。细菌除染色体带有遗传信息外，还存在质粒。遗传物质化学组成和DNA序列的差异原核生物DNA的化学组成差异很大，GC含量范围在24%~76%。通常同一种的细菌菌株间的序列差异可高达30%。基因组序列所揭示的遗传背景多样微生物的基因组测序工作的努力已经揭示了数万个新基因，主要的是编码酶的一些基因，其中大约三分之一可以被归到“有功能”的家族里，这是一个十分丰富、而且每天都在增加的新工业酶后选者的来源。随着微生物基因组学研究的深入，将会有大量新的工业酶被人类发现。中国基因组计划：测序1万

个微生物1995年国际上第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组测定完成，在随后的几年中，微生物的全基因组序列测定进展很快，近几年来随着基因组测序技术的快速发展，微生物基因组的测序变得更加简单，根据NCBI数据库的最新统计显示，已完成测序的5725种生物中病毒类2248种，细菌类1262种，古细菌82种，类病毒40种，另还有一些真核微生物。基因组学与应用生物学GenomicsandAppliedBiology2009,Vol.28(4):最新完成两种微生物基因组测序测序完毕的耐超高温热棒菌使研究人员可以一窥极端环境下生命的形式，而另一基因组测序的完成，则让科学家可以更好地了解一种令人讨厌的食肉细菌。

两个基因组序列都将发表在1月22日的《美国国家科学院学报》（ProceedingsoftheNationalAcademyofScience）上。来自美国加州大学洛杉矶分校、加州理工学院和德国雷根斯堡大学的一组科学家是在靠近意大利Maronti海滩的一个沸腾的海水孔中发现耐超高温热棒菌的。他们利用低覆盖随机鸟枪法（lowcoveragerandomshotguntechnique）测序了热棒菌共220万个碱基对的基因组。

研究小组识别了2,587个蛋白编码区，并最终确定热棒菌之所以具有惊人的耐高温特点，是因为它们体内缺少错配修复机制。这些用来修复DNA突变的功能是从大肠杆菌到人类都具备的普遍机制，但在至今测序的6种热棒菌中都未发现其存在。

因此，这项研究结果增加了热棒菌以一种“突变的生活方式”－－即不断经历未经修正的突变，来生活的可能性。研究作者在文章中写道，这些耐高温的原始生物可能是“生物体能够作为永久性突变体存活的一个极好的实例。”同时，在同一期杂志上，另一个研究小组也报道他们完成了产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens的测序工作。Clostridiumperfringens是一种厌氧型产芽孢革兰氏阳性菌，能够引发坏死性肠炎和气性坏疽。这组来自日本的研究人员认为他们的工作是首次对厌氧型革兰氏阳性病原体的测序。

研究人员选择这个细菌作为模式生物是因为它耐氧，生长迅速，易于操作。这种细菌通常寄生于人体和动物的肠道内，还可以侵入受伤组织，引起血毒症、休克甚至死亡。其遗传近亲包括C.tetani,C.botulinum

和C.difficile等，它们能引起顽固性痢疾和大肠炎。

研究人员共识别了2,660个蛋白编码区和20个新细菌毒性相关基因。小组成员包括来自日本日立公司、筑波大学、九州大学和Kitasato

大学、奈良市先进科学技术研究院和人类基因组研究小组等的科学家们。第二节微生物资源的开发利用程序

微生物资源的开发利用程序通常由总体设计、找到目的菌、效果试验、申请专利、菌种改良及发酵工艺研究、报批、生产、投放市场等相互关联的过程所组成。核心问题就是尽早获得所需的目的菌，而它决定开发资源的成败。

一、总体设计总体设计是微生物资源开发利用的首要任务，其核心是市场。创新是微生物资源开发的灵魂。总体设计一旦确定，核心问题就是尽早获得所需的目的菌。获取高效菌种是开发应用环境有益微生物并进一步实现产业化的基础，是该领域研究和开发的源头，也是产业化发展的核心与关键。二、目的菌的获得1.菌种来源及菌种分离引进、自行分离筛选2.筛选模型设计可根据作用机制、代谢途径的靶位、酶反应机制、目的化合物的类型等来设计初选模型。3.一菌多筛不清楚目标菌到底是那类微生物4.高通量筛选和组合生化利用高通量筛选设备；组合生化是用已知的有用化合物或已知骨架的化合物分别与不同的微生物共培养，然后分析不同培养时间化合物的结构及其活性的变化（发生修饰或转化），从而极大地增加了化合物的多样性，相应增加了获得理想化合物的可能性。二者结合起来，筛选的效能将大大提高。工业微生物获得的一般途怪1.目的工业微生物应具备的特性微生物是发酵生产成败的关键，用于生产的目的工业微生物必须具备以下一般特性：

a.必须是纯培养物．不含有其他微生物和噬菌体；

b.菌株遗传稳定性好，可长期保存；

c.易于产生大量营养细胞、孢子或其他繁殖体，在种子罐和其他用于制备大量种子的容器中培养时能够茁壮、快速繁殖；

d.菌株在较短的时间，一般在3天或更短的时间内能快速产生目的产物，并很少产生毒性物质或副产物；

e.菌株具有抵制其他杂菌感染和忍耐不良环境的能力．这种自我保护表现为pH值的降低，在较高的温度生长，或如对高浓度代谢产物的忍受力等；

f.对诱变剂敏感．可通过诱变达到提高菌种性能的目的。2.工业微生物的来源具有上述特性的微生物可以来自自然界也可以从微生物保藏单位获取、从自然界分离、纯化、筛选和鉴定一种傲生物需耍有经验的微生物专家。有时为了获取合适的微生物，必须去特定的生态环境中分离。食品工业中，另一个微生物来源是用于生产传统发酵食品的、经过上百年自然筛选留下的微生物。工业微生物的来源包括土壤，水，新鲜的、发酵的和腐烂的水果，有生命的动植物、废水，新鲜的和腐烂的食物，昆虫排泄物，还有蜜饯、酸菜、咸菜等。微生物的间接来源是菌种保藏单位，还有一些大型的发酵工厂也有其菌种保藏室。有的发酵并不需要采用纯的菌种，例如：发酵食品中的果蔬类，像泡菜生产过程中黄瓜的发酵。由干黄瓜上存在天然微生物就可以了。某些细菌的生长能够排斥其他的微生物，发酵过程不用纯的茵种也能达到纯种生产的目的。三、专利申请专利是国家保护知识产权的重要法律手段。专利申请的时机：一般应在确定某种新活性、新用途或新化合物时立即申请什么情况下不必申请专利：难以保护的技术方法：聘请法律顾问或专利申请代理人四、菌种改良及基因工程传统的理化诱变技术基因工程五、应用微生物的重点研究领域寻找发现新菌种利用现代生物技术改造菌种发展完善各种微生物环境保护应用技术微生物制剂的产业化极端微生物研究微生物分子生态学研究四、微生物资源研究的基本方法（一）单一菌种的分离鉴定样品采集富集培养纯化分离菌种鉴定(二)群落微生物分析方法16srDNA

基因序列分析分子指纹方法：RFLP、DGGE（TGGE）、RAPD核酸分子杂交技术生物标记物方法1.16srDNA

基因序列分析方法一从样品中分离总微生物DNAPCR扩增16SrDNA基因对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE）或温度梯度凝胶电泳（TGGE)，直接观察其多态性。引物Bif164-f(5′-GGGTGGTAATGCCGGATG-3′),Bif662-r(5′-CCACCGTTACACCGGGAA-3′)

庞小燕等（2005）[微生物学报,45(5):738-742]方法二（PCR-RFLP）从样品中分离总微生物DNAPCR扩增16SrDNA基因限制性内切酶酶切PCR扩增产物，然后用标记探针杂交，从而进行RFLP分析。毕江涛等（2009），沙冬青根瘤菌固氮酶基因nifHPCR-RFLP分析.西北农业学报，18(3):315-321.

摘要:利用固氮基因nifHPCR扩增,nifHPCR-RFLP及扩增产物序列分析方法对分离自宁夏和内蒙古部分地区的沙冬青根瘤菌代表菌株的nifH进行了遗传多样性和系统发育分析。结果表明,在80%相似水平上42株根瘤菌nifHPCR-RFLP基因图谱中有5个基因型聚类群。对不同基因型代表菌株的nifHPCR产物进行序列测定和系统发育关系分析,测试菌株在系统发育地位上与中慢生根瘤菌