ISO 10272-12017Amd 12023 食物链微生物学 弯曲杆菌的水平检测和计数方法 第1部分检测方法 修改件1耐热弯曲杆菌的分子确认和鉴定方法的包括 普雷斯顿肉汤中生长补充剂的使用和培养基性能测试的变化标准立项发展报告

食物链微生物学弯曲杆菌的水平检测和计数方法第1部分：检测方法修改件1：耐热弯曲杆菌的分子确认和鉴定方法的包括、普雷斯顿肉汤中生长补充剂的使用和培养基性能测试的变化标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfordetectionandenumerationofCampylobacterspp.—Part1:Detectionmethod—Amendment1:InclusionofmethodsformolecularconfirmationandidentificationofthermotolerantCampylobacterspp.,theuseofgrowthsupplementinPrestonbrothandchangesintheperformancetestingofculturemedia摘要弯曲杆菌（*Campylobacter*spp.）是全球范围内引发细菌性食源性疾病的首要病原菌之一，其检测和鉴定方法的标准化对于保障食品安全和公共健康具有重要意义。ISO10272-1:2017/Amd1:2023作为国际标准化组织发布的重要修订文件，针对食品链中弯曲杆菌水平检测方法进行了系统性技术更新。本报告全面梳理了该修改件的立项背景、技术内容、修订要点和国际影响，重点分析了其引入耐热弯曲杆菌分子确认与鉴定方法、优化普雷斯顿肉汤中生长补充剂使用方案以及完善培养基性能测试要求等核心变化。报告指出，该修改件的发布顺应了分子生物学技术在食品微生物检测领域深入应用的行业趋势，有效填补了传统培养方法与分子确认之间的衔接空白，显著提升了检测方法的特异性、灵敏度和标准化水平。本报告的编制旨在为该标准的推广应用、国内相关标准的同步修订以及食品微生物学实验室能力建设提供参考依据和技术支撑。关键词：弯曲杆菌；食物链微生物学；水平检测方法；分子确认；ISO10272-1；培养基性能测试；食品安全Keywords:Campylobacter;Microbiologyoffoodchain;Horizontaldetectionmethod;Molecularconfirmation;ISO10272-1;Culturemediaperformancetesting;Foodsafety一、引言弯曲杆菌感染是人类最常见的细菌性肠道传染病之一。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有超过9500万例弯曲杆菌病病例，其中绝大多数与食用受污染的食物（尤其是禽肉产品）有关。在欧盟，弯曲杆菌病已连续多年位居人类肠道人畜共患病报告病例数的首位，2022年报告确诊感染病例超过13.7万例，其公共卫生负担已超越沙门氏菌感染。在中国，随着食品安全监管体系的不断完善和检测能力的持续提升，弯曲杆菌在食品链中的污染状况也日益受到关注。ISO10272-1:2017《食物链微生物学弯曲杆菌的水平检测和计数方法第1部分：检测方法》是国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34/SC9）制定的关于食品和动物饲料中弯曲杆菌检测的基准性标准方法。该标准为各国食品安全监管机构、食品生产企业以及第三方检测实验室提供了统一的弯曲杆菌检测技术规范，是国际贸易中食品微生物安全指标互认的重要技术基础。然而，随着分子生物学技术的快速发展和应用普及，传统基于培养分离和生化鉴定的检测方法在时效性、特异性和通量方面逐渐显现出局限性。实时荧光定量PCR（qPCR）等分子技术能够在短时间内完成弯曲杆菌的属水平或种水平鉴定，但其与传统培养方法的衔接流程、结果判读标准以及方法性能验证要求等方面尚缺乏统一的国际规范。同时，实践表明，标准中推荐的普雷斯顿肉汤在部分食品基质中的增菌效率存在不足，培养基性能测试的判定标准也有待进一步完善。在此背景下，ISO/TC34/SC9启动了针对ISO10272-1:2017的技术修订工作，历经多轮国际讨论和实验室间验证研究，最终形成了ISO10272-1:2017/Amd1:2023修改件。该修改件经国际标准化组织于2023年1月25日正式发布，标志着弯曲杆菌检测国际标准在分子方法整合和应用适用性方面迈出了重要一步。二、标准立项背景（一）弯曲杆菌检测技术发展的内在需求弯曲杆菌属（*Campylobacter*）是一类微需氧或厌氧的革兰氏阴性弯曲杆菌，目前已发现超过30个种和亚种，其中与人类疾病最为密切的是空肠弯曲杆菌（*C.jejuni*）和大肠弯曲杆菌（*C.coli*），两者合计占临床感染病例的90%以上。此外，海鸥弯曲杆菌（*C.lari*）和乌普萨拉弯曲杆菌（*C.upsaliensis*）等耐热弯曲杆菌种也具有潜在的致病性，近年来在临床和食品样本中的检出率呈上升趋势。ISO10272-1:2017规定的检测流程主要包括选择性增菌、分离培养和生化鉴定三个环节。然而，该流程在实际应用中面临以下几方面突出挑战：1.鉴定周期较长：传统生化鉴定通常需要3-5天才能获得确定性结果，在食品安全事件应急处置和进出口食品快速放行等场景中难以满足时效性需求。2.表型鉴定局限性：部分弯曲杆菌种在生化特性上高度相似，传统表型方法难以实现准确区分。同时，弯曲杆菌在环境应激条件下可能进入活的非可培养状态（VBNC），导致传统培养方法出现假阴性结果。3.方法衔接空白：尽管实时荧光定量PCR等分子方法在检测实验室中已被广泛采用，但国际标准层面缺乏对这些方法与标准培养方法衔接的规范性指引，导致不同实验室之间的结果可比性不足。上述技术瓶颈构成了推动标准修订的核心内在驱动力。（二）国际食品微生物学标准发展的宏观趋势近年来，国际食品微生物学标准方法的发展呈现三个显著趋势：趋势一：分子生物学方法的标准化整合能力显著增强。国际标准化组织在多个食品微生物检测标准中逐步引入分子确认步骤，例如ISO6579-1中引入的PCR鉴定沙门氏菌的方法、ISO11290-1中通过修改件引入的单核细胞增生李斯特氏菌分子确认方法等。这些先行实践为弯曲杆菌检测标准的分子方法整合提供了可借鉴的技术框架和编写范式。趋势二：培养基质量控制要求日益精细化。ISO11133:2014《食品、饲料和水微生物学培养基的制备、生产、储存和性能测试》的发布全面提升了培养基性能测试的规范化水平。ISO10272-1:2017/Amd1:2023中对培养基性能测试的修改正是对这一国际趋势的积极响应和具体落实。趋势三：标准修订周期缩短，响应技术进步的速度加快。为适应食品微生物检测技术的快速迭代，ISO/TC34/SC9近年来通过修改件（Amendment）而非全面修订（Revision）的方式，对已发布标准中的特定技术内容进行精准更新，从而在保持标准框架稳定性的同时实现技术内容的及时跟进。（三）现行标准应用中反馈的突出问题自ISO10272-1:2017发布以来，各国标准化技术委员会和检测实验室在应用过程中反馈了若干具体问题，主要体现在以下方面：1.普雷斯顿肉汤中生长补充剂的配方可用性：原标准中规定的部分生长补充剂组分在部分国家和地区的商业可获得性存在差异，且不同品牌补充剂的实际促生长效果并不一致，影响了增菌步骤的稳健性和可重复性。2.培养基性能测试判定标准不够具体：原标准中关于培养基性能测试的规定较为笼统，对于目标菌的生长率、非目标菌的抑制程度以及平板计数方法的具体判定阈值缺乏定量化要求。3.分子确认方法的缺失：原标准未包含任何分子确认方法的技术内容，使得实验室在选择和使用分子确认手段时缺乏统一依据，也影响了不同实验室间检测结果的一致性。上述问题的集中反馈为本次修改件的制定提供了明确的改进方向。三、标准的主要内容和技术要点ISO10272-1:2017/Amd1:2023修改件对原标准的技术内容进行了针对性的补充和完善，主要涵盖以下三个核心方面。（一）耐热弯曲杆菌分子确认和鉴定方法的纳入该修改件最核心的技术内容是将分子确认和鉴定方法正式纳入标准框架。具体包括：1.方法原理：修改件规定了基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术的弯曲杆菌分子确认方法，靶向弯曲杆菌属特异性的16SrRNA基因序列以及空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的种特异基因序列。该类方法通过对培养阳性样本中的菌落或增菌液进行核酸提取和扩增，实现从"疑似阳性"到"确认阳性"的判定。2.操作流程：修改件详细规定了分子确认的操作流程，包括DNA提取方法（热裂解法或商业试剂盒法）、引物和探针序列、扩增反应条件（退火温度、循环参数）、阳性对照和阴性对照的设置要求、以及结果判读标准。特别强调了在分子确认过程中应设置适当的内部扩增对照（IAC），以监测PCR抑制物的存在并确保结果的有效性。3.与培养方法的衔接：分子确认可在两种场景下实施——一是对选择性琼脂平板上获得的典型或可疑菌落进行确认，此时分子确认结果可直接替代传统的生化鉴定步骤；二是对增菌液直接进行分子筛查，阳性结果需进一步通过分离培养获得纯培养物后方可报告。修改件明确指出，分子确认方法不改变原标准中规定的增菌和分离培养步骤，而是作为传统生化鉴定方法的替代或补充手段。4.方法性能要求：修改件规定，所使用的分子确认方法须经验证，其对弯曲杆菌检测的灵敏度和特异性应不低于传统生化鉴定方法，并提供了方法验证的参考方案和性能指标。（二）普雷斯顿肉汤中生长补充剂使用的优化针对普雷斯顿肉汤在实际应用中的配方可用性和增菌效率问题，修改件对生长补充剂的使用进行了如下优化：1.明确了补充剂的配方组成：修改件对普雷斯顿肉汤中生长补充剂的具体组分（包括头孢哌酮、两性霉素B、利福平等选择性抗菌成分以及促生长营养成分）的添加量和配制方法进行了更为详细的规定，减少了因组分不明确导致的不同实验室间配制差异。2.增加了商品化补充剂的验收要求：修改件增加了对商品化生长补充剂进行质量验收的规定，要求实验室在使用商业来源的生长补充剂时，应通过阳性菌株生长试验和阴性菌株抑制试验对其性能进行验证，确保其符合标准要求。3.提供了替代配方的灵活性：在保证等效性能的前提下，修改件允许实验室根据实际情况选择等效的商业化成品培养基或自行配制的培养基，但须提供充分的性能验证数据以证明等效性。这一规定在保证方法严谨性的同时增强了标准的可操作性。（三）培养基性能测试要求的完善培养基性能测试是确保检测结果可靠性的重要技术保障。修改件对原标准中关于培养基性能测试的内容进行了以下完善：1.定量化判定标准：修改件引入了更为具体的定量判定指标，包括目标菌在选择性培养基上的生长率（应不低于70%）和非目标菌的抑制率（应达到完全抑制或菌落数不超过规定限值），为实验室的培养基验收提供了明确的量化依据。2.参考菌株谱系的更新：修改件对培养基性能测试中应使用的参考菌株进行了更新和补充。在原有标准菌株的基础上，补充了更多来自食品基质的分离菌株和参考培养物，以更全面地评估培养基对不同来源弯曲杆菌菌株的支持能力。同时增加了非目标菌（如大肠埃希氏菌、肠球菌属等）的代表性菌株，用于验证选择性抑制效果。3.测试频率和记录要求的明确：修改件规定了培养基性能测试的最低频率要求（每批次培养基均须进行测试）、测试条件（包括培养温度、气体环境、培养时间等）以及测试结果的记录和保存要求，为实验室质量管理体系的实施提供了更为具体的技术依据。4.与ISO11133的协调一致：修改件明确指出其培养基性能测试要求与ISO11133:2014的规定保持一致，确保了两份标准之间的协调性和兼容性。四、参与制定的主要单位介绍ISO10272-1:2017/Amd1:2023的修订工作由国际标准化组织食品委员会微生物学分委员会（ISO/TC34/SC9）主导组织。SC9负责食品链微生物学方法标准的制定和修订工作，其秘书处由丹麦标准化组织（DS）承担。在修改件的起草和审议过程中，法国标准化协会（AFNOR）下属的食品微生物学标准化委员会发挥了尤为突出的技术引领作用。法国标准化协会（AFNOR）是法国国家标准化主管机构，在食品微生物学标准领域拥有深厚的技术积累和丰富的实践经验。其下属的食品微生物学标准化委员会负责法国国内食品微生物学相关标准的制修订工作，并代表法国参与ISO/TC34/SC9的国际标准制定活动。在本次修改件的制定过程中，法国专家团队牵头承担了分子确认方法的验证研究和文本起草工作。法国国家食品安全局（ANSES）下属的食品参考实验室为修改件中qPCR方法的设计、实验室间验证以及性能指标的确定提供了关键的实验数据和专业技术支撑。此外，来自德国标准化协会（DIN）的微生物学标准委员会亦积极参与了培养基性能测试部分的修订工作，其专家在培养基质量控制领域的研究成果为修改件中定量化判定标准的制定提供了重要的科学依据。在修改件的制定过程中，SC9采取了一系列严谨的工作程序确保标准质量。各成员国通过设立特别工作组（WorkingGroup）或直接在国家层面组织专家参与技术讨论和草案评议，经过多轮征求意见、逐条审议和协商一致，最终推动该修改件以协商一致方式通过成员国投票。修改件从立项到正式发布历时约30个月，充分体现了国际标准制定过程中技术严谨性与程序规范性并重的特点。五、标准实施的意义与影响（一）检测效率和准确性的大幅提升分子确认方法的引入从根本上改变了弯曲杆菌检测确认环节的技术路径。传统生化鉴定方法通常需要48-72小时才能获得确认结果，而实时荧光定量PCR方法可在DNA提取完成后2-3小时内完成检测。综合考虑增菌和分离培养所需时间，整个检测流程的总周期可从原先的5-7天缩短至3-4天。在食品安全事件应急处置中，这一时间优势对于快速溯源和及时采取控制措施具有重要价值。（二）食品安全监管能力的有效增强该修改件的发布为各国食品安全监管机构提供了更加完善的技术工具。通过将分子确认方法和培养方法有机结合，监管实验室能够更加准确地区分弯曲杆菌的不同种，为流行病学调查和溯源分析提供更加精准的数据支撑。同时，培养基性能测试要求的完善将有助于提高各实验室检测结果的一致性和可比性，为国际贸易中食品安全指标的互认创造更加有利的技术条件。（三）对实验室能力建设和技术更新的促进该修改件对实验室提出了新的技术要求，包括分子检测能力的建设、培养基质量控制的规范化等。这将在客观上推动食品微生物学实验室的技术升级和能力提升，促进实时荧光定量PCR等先进分子检测平台在食品安全检测领域的普及应用。同时，修改件中关于方法验证和性能指标的要求，也为实验室的质量管理体系运行提供了更加明确的技术参考。（四）对中国相关标准和技术体系的启示ISO10272-1:2017/Amd1:2023的发布对中国食品微生物学标准体系建设具有重要的参考价值和借鉴意义。目前，中国现行有效的食品安全国家标准GB4789.9-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲杆菌检验》在样品处理、增菌培养和分离鉴定等方面与ISO10272-1:2017存在一定程度的对应关系，但在分子确认方法、培养基性能测试的定量化要求等方面尚需进一步完善。建议国内相关标准化技术机构密切跟踪该修改件的实施情况，适时启动国内标准的同步修订工作，推动我国弯曲杆菌检测技术与国际先进水平接轨。六、结论与展望ISO10272-1:2017/Amd1:2023的发布是弯曲杆菌检测国际标准化进程中的一个重要里程碑。该修改件通过将分子确认和鉴定方法正式纳入标准框架、优化普雷斯顿肉汤中生长补充剂的使用规定、以及完善培养基性能测试的定量化要求，有效地回应了标准化实践中反馈的突出问题，顺应了分子生物学技术在食品微生物检测领域深入应用的行业发展趋势，为全球食品链中弯曲杆菌的标准化检测提供了更加科学、高效和可靠的技术依据。展望未来，弯曲杆菌检测标准化工作仍将持续演进。在技术层面，随着新一代测序（NGS）技术和数字PCR技术在食品微生物学领域的应用日益成熟，这些新技术有望在下一轮标准修订中被纳入考量。在方法层面，从"培养依赖型"向"培养与非培养方法并重"的范式转变将进一步深化，多重检测技术（同时检测多种病原菌）的集成化标准方法也将成为重要发展方向。在协调层面，ISO10272系列标准的各部分之间将进一步增强技术衔接和方法一致性，同时与CodexAlimentarius委员会相关文件以及各国标准化机构之间的协调工作也将持续加强。建议国内相关标准化技术机构、食品安全监管部门、检验检测机构和食品生产企业密切关注该修改件的实施动态，做好技术储备和人员培训工作，为国内标准的同步更新和国际标准的转化实施奠定坚实基础。参考文献[1]ISO10272-1:2017/Amd1:2023,Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodfordetectionandenumerationofCampylobact