嗜热毛壳菌CuZn - SOD基因过表达对转基因水稻三种病害抗性的提升研究

嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因过表达对转基因水稻三种病害抗性的提升研究一、引言1.1研究背景与意义水稻作为全球最重要的粮食作物之一，为世界上半数以上人口提供主食。然而，水稻在生长过程中面临着多种病害的威胁，这些病害严重影响水稻的产量和品质。水稻白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病是水稻生产中常见且危害较大的三种病害。水稻白叶枯病由黄单胞杆菌稻致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）引起，是一种典型的细菌性维管束病害。病菌主要从水稻叶片的水孔、伤口等部位侵入，在维管束中繁殖并扩展，导致叶片出现枯黄症状，严重时全叶枯死，犹如火烧状，对水稻的光合作用和物质运输造成极大阻碍，从而显著降低水稻产量，一般发病田块减产10-30%，重病田减产可达50%以上，甚至绝收。例如，在一些高温多雨的水稻种植区，若防控措施不当，白叶枯病极易爆发流行，给农民带来巨大的经济损失。细菌性条斑病则是由稻黄单胞杆菌稻生致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola）引发，主要危害水稻叶片。病斑初为暗绿色水渍状小斑，后沿叶脉扩展成黄褐色细条斑，湿度大时病斑上会溢出大量串珠状黄色菌脓。该病害不仅影响叶片的正常生理功能，还会降低水稻的结实率和千粒重，造成产量损失。在台风频繁、种植感病品种较多的地区，细菌性条斑病往往发生严重，如我国南方部分稻区，每年因该病导致的产量损失不容忽视。纹枯病是由立枯丝核菌（RhizoctoniasolaniKühn）引起的真菌性病害，也是水稻上的重要病害之一。该病主要发生在水稻的叶鞘和叶片上，初期在近水面的叶鞘上出现暗绿色水渍状小斑，后逐渐扩大并相互融合成云纹状大斑，病斑中央灰白色，边缘暗褐色。随着病情发展，病斑向上蔓延，导致叶片枯黄、植株倒伏，严重影响水稻的灌浆和结实，一般减产10-20%，在高肥密植、高温高湿的环境下，减产幅度可达30%以上。传统的水稻病害防治方法主要依赖化学农药，但长期大量使用化学农药不仅会导致病原菌产生抗药性，还会对环境造成污染，危害生态平衡和人类健康。因此，培育抗病品种成为防治水稻病害的重要策略之一。利用基因工程技术将具有抗病功能的基因导入水稻，从而提高水稻的抗病性，为水稻抗病育种提供了新的途径。嗜热毛壳菌（Chaetomiumthermophilum）是一种广泛存在于高温环境中的真菌，其CuZn-SOD基因编码的铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）具有独特的生物学功能。超氧化物歧化酶（SOD）是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基（O_2^-）歧化为氧气（O_2）和过氧化氢（H_2O_2），在植物细胞抗氧化防御系统中发挥着关键作用。当植物受到病原菌侵染时，细胞内会产生大量的活性氧（ROS），如超氧阴离子自由基等，这些ROS如果不能及时清除，会对细胞造成氧化损伤，影响植物的正常生长和发育。而SOD能够及时清除超氧阴离子自由基，维持细胞内的氧化还原平衡，从而增强植物对病原菌的抵抗能力。嗜热毛壳菌的CuZn-SOD基因由于其来源的特殊性，可能编码具有更强抗氧化活性或特殊功能的SOD，将其导入水稻中，有望提高水稻对多种病害的抗性。本研究旨在通过将嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因导入水稻，探究其对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病抗性的影响，为水稻抗病育种提供新的基因资源和理论依据，对于保障水稻的安全生产、减少化学农药使用、保护环境以及促进农业可持续发展具有重要意义。1.2国内外研究现状在水稻白叶枯病的研究方面，国内外学者对病原菌的致病机制、水稻的抗病机理以及抗病品种的选育等方面进行了大量研究。研究发现，病原菌通过分泌多种致病因子，如效应蛋白等，干扰水稻细胞的正常生理功能，从而引发病害。水稻自身则通过识别病原菌的分子模式，激活一系列防御反应来抵抗病原菌的入侵。目前，已经鉴定出多个与水稻白叶枯病抗性相关的基因，如Xa1、Xa21等，并对这些基因的功能和作用机制进行了深入研究。在抗病品种选育方面，通过常规杂交育种和分子标记辅助选择等技术，已经培育出一些具有白叶枯病抗性的水稻品种，但由于病原菌的变异和新小种的出现，抗病品种的抗性持久性面临挑战。对于水稻细菌性条斑病，国内外研究主要集中在病原菌的生物学特性、病害的发生流行规律以及防治技术等方面。明确了病原菌的侵染循环和发病条件，发现高温高湿、台风暴雨等气候条件有利于病害的发生流行。在防治技术上，除了化学防治外，也在探索生物防治和农业防治等综合防治措施。同时，对水稻抗细菌性条斑病的遗传机制研究也取得了一定进展，定位了一些与抗性相关的数量性状位点（QTL），但对抗病基因的克隆和功能研究相对较少。水稻纹枯病的研究主要围绕病原菌的生物学特性、致病机制、病害的发生规律以及防治策略展开。了解到纹枯病菌具有广泛的寄主范围和较强的适应性，其致病机制涉及多种酶和毒素的作用。在防治方面，化学防治仍然是主要手段，但由于纹枯病菌对一些化学农药产生了抗药性，生物防治和抗病品种选育受到越来越多的关注。在抗病基因挖掘方面，虽然已经鉴定出一些与纹枯病抗性相关的QTL，但尚未克隆到具有重大应用价值的主效抗病基因。超氧化物歧化酶（SOD）的研究始于20世纪60年代，目前已经在多种生物中得到广泛研究。根据其辅因子的不同，SOD主要分为铜锌型（CuZn-SOD）、铁型（Fe-SOD）和锰型（Mn-SOD）三类。在植物中，SOD参与了植物对多种生物和非生物胁迫的响应过程。研究表明，在干旱、盐害、低温等非生物胁迫下，植物体内SOD的活性会显著增加，以清除过多的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。在生物胁迫方面，当植物受到病原菌侵染时，SOD活性也会发生变化，且转基因植物过量表达SOD基因能够增强对病原菌的抗性。例如，将烟草的CuZn-SOD基因导入番茄中，转基因番茄对灰霉病的抗性显著提高；将拟南芥的Mn-SOD基因转入水稻，转基因水稻对稻瘟病的抗性增强。然而，关于嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因在提高水稻对多种病害抗性方面的研究尚未见报道。1.3研究目的与方法本研究的目的是通过基因工程技术，将嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因导入水稻，获得转基因水稻植株，并对转基因水稻对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病的抗性进行鉴定和分析，明确该基因在提高水稻抗病性方面的作用，为水稻抗病育种提供新的基因资源和技术支持。在研究方法上，首先采用PCR技术从嗜热毛壳菌基因组DNA中克隆CuZn-SOD基因，然后将该基因连接到植物表达载体上，构建重组表达载体。通过农杆菌介导法将重组表达载体转化水稻愈伤组织，经过筛选、分化和再生等过程，获得转基因水稻植株。对转基因水稻植株进行分子检测，包括PCR检测、Southern杂交检测和RT-PCR检测等，以确定目的基因是否成功整合到水稻基因组中以及是否正常表达。采用人工接种病原菌的方法，对转基因水稻进行白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病的抗性鉴定，通过调查发病症状、计算病情指数等指标，评价转基因水稻的抗病能力。同时，测定转基因水稻在接种病原菌前后体内SOD活性、丙二醛（MDA）含量等生理指标的变化，分析该基因提高水稻抗病性的生理机制。二、相关理论基础2.1水稻三种病害概述水稻白叶枯病是一种全球性的水稻细菌性病害，广泛分布于亚洲、非洲、美洲等主要水稻种植区域。在我国，水稻白叶枯病在南方稻区发生较为普遍，尤其是在长江流域及其以南地区，如广东、广西、湖南、湖北、江西等地，这些地区气候温暖湿润，适宜病原菌的生存和繁殖。其危害症状较为典型，主要表现为叶片受害。在叶枯型症状中，病菌多从叶缘或叶尖侵入，初期呈现暗绿色水渍状短条斑，随后病斑迅速扩展，颜色变为暗褐色，周围形成淡黄白色病斑，最终病斑沿叶缘或中脉向上下延伸，转为黄褐色，最后呈枯白色，病斑边缘有时呈不规则波纹状，与健部界限明显。急性型症状则通常出现在环境条件适宜且水稻品种感病时，病斑呈暗绿色，似水渍状，叶片迅速失水青枯，病部常产生大量黄色菌脓。病原为黄单胞杆菌稻致病变种，该病原菌为革兰氏阴性菌，短杆状，极生单鞭毛。病原菌存在明显的生理分化现象，可分为多个小种，不同小种的致病力存在差异。其传播途径主要包括风雨传播、流水传播、农事操作传播以及种子传播。病原菌主要通过水稻叶片的水孔、伤口等部位侵入，在维管束中大量繁殖并扩展，从而导致病害的发生。高温、高湿的环境条件有利于病害的流行，尤其是在台风、暴雨过后，病害容易迅速蔓延。此外，偏施氮肥、种植感病品种、水稻生长后期田间通风透光不良等因素也会加重病害的发生。水稻细菌性条斑病在东南亚、南亚、非洲等水稻产区均有发生，在我国主要分布于南方稻区，如海南、广东、广西、福建、浙江等地。主要危害水稻叶片，病斑初为暗绿色水渍状小斑，后沿叶脉迅速扩展成黄褐色细条斑，病斑两端呈浸润型绿色，病斑上常溢出许多露珠状黄色菌脓，干后呈黄色胶状小粒，不易脱落。发病严重时，病斑融合成不规则黄褐至枯白大斑，与白叶枯病症状相似，但对光可见许多半透明细条，严重时叶片卷曲，田间呈现一片黄白色，导致植株早期死亡或不能抽穗。病原是稻黄单胞杆菌稻生致病变种，同样为革兰氏阴性菌，短杆状，极生单鞭毛。病原菌也存在不同的生理小种，其致病力有所不同。主要通过风雨、流水传播，也可通过农事操作、昆虫等媒介传播。病原菌主要从叶片的气孔、伤口侵入。高温、高湿且多雨少光照的环境条件有利于病害的发生，一般在温度26-30℃，相对湿度大于85%时，病害发生几率较高。此外，稻田深水灌溉、田水串灌、底肥不足、氮肥施用过多等不良栽培管理措施会加重病害的发生。水稻纹枯病是一种世界性的水稻病害，在全球各大水稻产区均有分布，在我国各水稻种植区普遍发生，尤其是南方高温高湿地区发生更为严重。从苗期至穗期均可发病，主要危害叶鞘和叶片，严重时也会危害茎秆和穗部。叶鞘染病初期在近水面处产生暗绿色水浸状边缘模糊小斑，后渐扩大呈椭圆形或云纹形，边缘暗褐，中部呈灰白色半透明状，潮湿时为灰绿色。叶片染病，病斑也呈云纹状，边缘褪黄，发病快时病斑呈污绿色，叶片很快腐烂。茎秆染病症状似叶片，后期呈黄褐色，易折。穗颈染病初为湿润状青黑色，常不能抽穗，抽穗的秕谷较多，千粒重下降。湿度大时，病部长出白色网状菌丝，后形成菌核。病原为立枯丝核菌，属于半知菌亚门真菌，菌丝多核，无色，分枝处呈直角，分枝基部稍缢缩，离分枝不远处有分隔。该病原菌具有较强的腐生性和广泛的寄主范围，除水稻外，还可侵染玉米、小麦、大豆等多种作物。病原菌主要以菌核在土壤、病稻草和其他寄主残体上越冬，成为次年病害发生的主要初侵染源。水稻收割时落入田中的大量菌核可在田间存活多年，当环境条件适宜时，漂浮在水面上的菌核黏附在稻株基部叶鞘上，萌发菌丝侵入组织。发病后，病斑上形成的新菌核随水漂浮或通过菌丝蔓延进行再侵染，实现病害在田间的扩散传播。纹枯病属高温高湿型病害，发病适温为22-28℃（范围18-34℃），湿度是影响流行的关键因素。当田间小气候相对湿度达80%以上时病害迅速发展，71%以下时病害停止发展。栽培因素如粳稻品种通常较籼型杂交稻易感病；栽插密度过大、偏施迟施氮肥、连续深水灌溉、连年重茬种植等栽培方式均有利于病害发生。2.2植物免疫系统植物免疫系统是植物抵御病原菌侵染的重要防线，主要包括先天免疫系统和后天免疫系统。先天免疫系统是植物在长期进化过程中形成的固有防御机制，能够识别病原菌表面保守的分子模式，即病原体相关分子模式（PAMP），如细菌的鞭毛蛋白、脂多糖，真菌的几丁质等。植物细胞表面的模式识别受体（PRR）能够识别PAMP，从而激活一系列防御反应，如活性氧（ROS）的爆发、细胞壁的加固、植保素的合成以及病程相关蛋白的表达等，这种免疫反应被称为PAMP触发免疫（PTI）。PTI是植物对病原菌的初级防御反应，能够有效抑制大多数病原菌的侵染。然而，病原菌为了突破植物的防御，会分泌效应子进入植物细胞，干扰植物的正常生理功能，抑制PTI。为了应对病原菌的攻击，植物进化出了后天免疫系统，即效应子触发免疫（ETI）。植物通过抗病基因（R基因）编码的抗病蛋白识别病原菌分泌的效应子，引发强烈的免疫反应，如超敏反应（HR），导致侵染部位的细胞迅速死亡，从而限制病原菌的扩散。ETI是植物对病原菌的特异性防御反应，能够提供更强的抗病能力。在水稻应对病害的过程中，植物免疫系统发挥着至关重要的作用。例如，当水稻受到白叶枯病菌侵染时，水稻细胞表面的PRR能够识别白叶枯病菌的PAMP，激活PTI，诱导水稻产生一系列防御反应，如细胞壁加厚、合成抗菌物质等。如果白叶枯病菌分泌效应子来抑制PTI，水稻则可以通过R基因编码的抗病蛋白识别效应子，启动ETI，产生超敏反应，阻止病菌的进一步侵染。同样，在水稻抵抗细菌性条斑病和纹枯病的过程中，植物免疫系统也通过PTI和ETI机制发挥作用，识别病原菌并激活相应的防御反应，保护水稻免受病害的侵害。然而，病原菌也会不断进化，变异其PAMP或效应子，以逃避植物免疫系统的识别和攻击，这就导致了水稻与病原菌之间的长期“军备竞赛”。深入研究植物免疫系统在水稻抗病中的作用机制，对于培育抗病水稻品种、提高水稻的抗病能力具有重要意义。2.3超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（SOD）是一类广泛存在于生物体内的金属酶，根据其辅因子的不同，主要分为铜锌型（CuZn-SOD）、铁型（Fe-SOD）和锰型（Mn-SOD）三类。CuZn-SOD主要存在于真核细胞的细胞质、叶绿体和过氧化物酶体中，呈蓝绿色，其相对分子量约为32kDa，分子由两个相同的亚基通过非共价键疏水相互作用缔合成一个“口袋”状二聚体，每个亚基含一个铜离子（Cu^{2+}）和一个锌离子（Zn^{2+}）。Cu^{2+}与四个组氨酸残基和一个水分子配位，形成畸变的四方锥结构，构成酶的活性中心，而Zn^{2+}则与三个组氨酸残基的咪唑氮和一个天冬门氨酸残基的羧基氧配位，形成扭曲的四面体结构，Cu^{2+}和Zn^{2+}之间通过共同连接的组氨酸形成“咪唑桥”结构。Fe-SOD主要分布在原核细胞以及部分植物的叶绿体和线粒体中，呈黄褐色，相对分子量约为38.7kDa。Mn-SOD主要定位于真核细胞的线粒体和原核细胞中，呈紫红色，相对分子量约为40kDa。SOD具有高度的稳定性，在75℃下加热数分钟仍很少失活，对酸碱也较稳定，可在pH5.3-10.5范围内发挥作用。其主要功能是催化超氧阴离子自由基（O_2^-）歧化为氧气（O_2）和过氧化氢（H_2O_2），在生物体内的抗氧化防御系统中起着关键作用。当生物体受到各种生物和非生物胁迫时，细胞内会产生大量的O_2^-，这些自由基如果不能及时清除，会对细胞的脂质、蛋白质和核酸等生物大分子造成氧化损伤，影响细胞的正常功能和代谢。而SOD能够及时将O_2^-转化为O_2和H_2O_2，从而保护细胞免受氧化损伤，维持细胞内环境的稳定。关于SOD的基因克隆，目前已经从多种生物中成功克隆出SOD基因，包括细菌、真菌、植物和动物等。通过基因克隆技术，可以深入研究SOD基因的结构、功能和表达调控机制。在功能研究方面，大量研究表明，SOD在植物的生长发育、抗逆性等方面具有重要作用。在植物受到干旱、盐害、低温等非生物胁迫时，植物体内SOD的活性会显著增加，以清除过多的活性氧，保护细胞免受氧化损伤，提高植物的抗逆性。在生物胁迫方面，当植物受到病原菌侵染时，SOD活性也会发生变化，参与植物的抗病过程。CuZn-SOD在植物抗病中发挥着重要作用。当植物受到病原菌侵染时，细胞内的氧化还原平衡被打破，产生大量的活性氧，其中O_2^-是主要的活性氧之一。CuZn-SOD能够迅速清除O_2^-，防止其积累对细胞造成损伤。同时，H_2O_2作为SOD催化反应的产物，在植物抗病中也具有重要的信号传导作用。适量的H_2O_2可以激活植物的防御反应，如诱导病程相关蛋白的表达、促进植保素的合成等，从而增强植物对病原菌的抵抗能力。此外，CuZn-SOD还可能参与植物细胞内的其他生理过程，间接影响植物的抗病性。例如，它可能通过调节植物激素的信号传导途径，影响植物的生长发育和抗病反应。三、实验材料与方法3.1实验材料本实验选用嗜热毛壳菌（Chaetomiumthermophilum）作为目的基因的供体菌株，该菌株保存于本实验室的甘油管中，-80℃冰箱保存。水稻品种为粳稻日本晴（OryzasativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare），其种子由中国农业科学院作物科学研究所提供。农杆菌菌株EHA105用于介导基因转化，植物表达载体pCAMBIA1301由本实验室保存。大肠杆菌菌株DH5α用于质粒的扩增和保存。主要试剂包括DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser（反转录试剂盒）、SYBR®PremixExTaq™II（荧光定量PCR试剂盒），均购自TaKaRa公司。限制性内切酶BamHI、HindIII，T4DNA连接酶购自NEB公司。高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo购自TOYOBO公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他常规试剂如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯试剂。仪器设备主要有PCR仪（Bio-Rad公司，T100™ThermalCycler），用于基因扩增；高速冷冻离心机（Eppendorf公司，5424R），用于DNA、RNA提取及质粒提取过程中的离心操作；凝胶成像系统（Bio-Rad公司，GelDoc™EZImager），用于观察和记录PCR扩增产物及酶切产物的电泳结果；恒温摇床（NewBrunswick公司，Innova42R），用于细菌培养；荧光定量PCR仪（ABI公司，QuantStudio6Flex），用于基因表达水平的检测；超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-2FD），用于无菌操作；高压灭菌锅（日本三洋公司，MLS-3780），用于培养基及实验器具的灭菌。3.2CtSOD的扩增与载体构建以嗜热毛壳菌的基因组DNA为模板，根据GenBank中登录的嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因（CtSOD）序列（登录号：XXXXXX），使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物P1：5'-CGGGATCCATGGCCTCCAAGGACCTG-3'（下划线部分为BamHI酶切位点），下游引物P2：5'-CCCAAGCTTTCACGCTGCTGCTGCTG-3'（下划线部分为HindIII酶切位点）。PCR反应体系（50μL）：10×KOD-Plus-NeoBuffer5μL，dNTPs（2mMeach）5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶（1U/μL）1μL，模板DNA（50ng/μL）1μL，ddH₂O36μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；最后68℃延伸5min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否扩增出目的条带。将PCR扩增得到的目的产物进行切胶回收。使用DNA凝胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书操作。将含有目的条带的琼脂糖凝胶切下，放入1.5mL离心管中，加入适量的溶胶液，55-65℃水浴至凝胶完全融化。将融化后的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。加入适量的洗涤液洗涤吸附柱，12000rpm离心1min，弃滤液。重复洗涤一次，最后12000rpm离心2min，将吸附柱放入新的离心管中，加入适量的洗脱缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心1min，收集洗脱液，即为回收的目的DNA片段。对空载体pCAMBIA1301和回收的目的片段分别进行双酶切。酶切体系（20μL）：10×Buffer2μL，BamHI（10U/μL）1μL，HindIII（10U/μL）1μL，DNA（载体或目的片段）10μL，ddH₂O6μL。37℃水浴酶切2-3h。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒分别回收酶切后的载体片段和目的片段。将回收的酶切载体片段和目的片段进行连接反应。连接体系（10μL）：T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶（350U/μL）1μL，载体片段（50ng/μL）1μL，目的片段（50ng/μL）6μL，ddH₂O1μL。16℃连接过夜。将连接产物热激转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取10μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴2min。加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h。将菌液5000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液重悬沉淀，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取平板上的单菌落，接种于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切体系同上述双酶切体系，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否切出目的条带，以验证重组质粒的正确性。将鉴定正确的重组质粒命名为pCAMBIA1301-CtSOD。将重组质粒pCAMBIA1301-CtSOD电击转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。取1μg重组质粒加入到100μLEHA105感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预冷的电击杯中，冰浴5min。使用电击仪（Bio-Rad公司，GenePulserXcell™）进行电击转化，参数设置为：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω。电击后迅速加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养2-3h。将菌液5000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液重悬沉淀，涂布于含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，28℃倒置培养2-3d。挑取平板上的单菌落，进行PCR鉴定和测序验证，以确保重组质粒成功转化至农杆菌中。3.3转基因阳性水稻的获得采用农杆菌介导的遗传转化方法将重组质粒pCAMBIA1301-CtSOD导入水稻愈伤组织。选取饱满的水稻种子，去壳后用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次。再用2.5%次氯酸钠溶液浸泡30min，期间不断振荡，然后用无菌水冲洗5-6次，直至无次氯酸钠气味。将消毒后的种子接种到诱导培养基（MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8）上，28℃黑暗培养3-4周，诱导愈伤组织。将鉴定正确的含有重组质粒的农杆菌EHA105单菌落接种于含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.8。5000rpm离心5min，收集菌体，用含有乙酰丁香酮（100μM）的AAM液体培养基重悬菌体，调整OD₆₀₀值为0.5，即为侵染液。将诱导得到的水稻愈伤组织浸泡在侵染液中，侵染30min，期间轻轻振荡。侵染结束后，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的菌液，将愈伤组织转移到共培养基（MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+乙酰丁香酮100μM，pH5.8）上，25℃黑暗共培养3d。共培养结束后，将愈伤组织转移到含有潮霉素（50mg/L）的筛选培养基（MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+头孢噻肟钠250mg/L+羧苄青霉素250mg/L，pH5.8）上，28℃黑暗筛选培养2-3周，每2周更换一次筛选培养基。筛选出的抗性愈伤组织转移到分化培养基（MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+潮霉素50mg/L+头孢噻肟钠250mg/L+羧苄青霉素250mg/L，pH5.8）上，28℃光照培养（光照强度3000-4000lx，光照时间16h/d），诱导分化出芽。当芽长至2-3cm时，将其转移到生根培养基（1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.8）上，28℃光照培养，诱导生根。待根系发育良好后，将再生植株移栽到温室中，进行炼苗和生长。采用CTAB法提取转基因水稻植株的基因组DNA。取0.1g水稻叶片，放入预冷的研钵中，加入适量的液氮，迅速研磨成粉末状。将粉末转移至1.5mL离心管中，加入600μL2×CTAB提取缓冲液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%β-巯基乙醇，使用前加入），轻轻混匀，65℃水浴30min，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次。水浴结束后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。将上清液转移至新的离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min。12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，风干后加入50μLTE缓冲液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，-20℃保存备用。以提取的转基因水稻基因组DNA为模板，使用引物P1和P2进行PCR检测。PCR反应体系和反应程序同CtSOD基因扩增时的体系和程序。取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与目的基因大小一致的条带，则表明目的基因已整合到水稻基因组中。采用GUS组织化学染色法对转基因水稻进行进一步检测。取转基因水稻的叶片、茎段、根等组织，放入GUS染色液（50mM磷酸钠缓冲液，pH7.0；1mMX-Gluc；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；0.1%TritonX-100）中，37℃避光染色12-24h。染色结束后，用70%乙醇脱色，直至背景清晰。在显微镜下观察染色结果，若组织呈现蓝色，则表明GUS基因表达，进一步证明目的基因已成功导入水稻中。通过上述方法，获得转基因阳性水稻植株。3.4SOD酶活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定SOD酶活性。其原理是：在光照条件下，核黄素可被光还原，还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化，使O₂被单电子还原产生超氧阴离子自由基（O_2^-），O_2^-则可将NBT还原成蓝色的甲臜，后者在560nm处有最大吸收值。SOD能够清除O_2^-，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，酶活性越高，抑制作用越强，反应液的蓝色越浅。因此可通过测定A₅₆₀来计算SOD活性，以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。SOD粗酶液的提取：取0.5g水稻叶片，加入2mL预冷的50mM磷酸缓冲液（pH7.8，内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）），在冰浴中研磨匀浆，转移至10mL量瓶中，用提取介质冲洗研钵2-3次（每次1-2mL），合并冲洗液于量瓶中，定容至10mL。取5mL提取液于4℃下10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗酶液。SOD活性测定：取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管7支，其中测定管3支、光下对照管3支，暗中对照（调零）1支。按照表1加入反应显色试剂：反应试剂/mL测定管光下对照暗中对照50mM磷酸缓冲液1.51.51.5130mM甲硫氨酸（Met）溶液0.30.30.3750μmol/LNBT溶液0.30.30.3100μmol/LEDTA-Na₂0.30.30.320μmol/L核黄素溶液0.30.30.3粗酶液0.100蒸馏水0.50.60.67号试管加入核黄素后立即用双层黑色硬纸套遮光，全部试剂加完后摇匀，将试管置于4000lx荧光灯下显色反应15-20min（要求各管照光要一致，反应温度控制在25-35℃之间，视光下对照管的反应颜色和酶活性的高低适当调整反应时间）。反应结束后用黑布罩遮盖试管终止反应。以暗中对照作空白（调零），在560nm下测定1-6号试管反应液的吸光度，记录测定数据。SOD活性计算：SOD活性（U/gFW）=\frac{(A_0-A_s)\timesV_t}{A_0\times0.5\timesV_s\timesFW}其中，A_0为光下对照管吸光度；A_s为样品测定管吸光度；V_t为样品提取液总体积（mL）；V_s为测定时取粗酶液量（mL）；FW为样品鲜重（g）。3.5水稻材料接种鉴定水稻白叶枯病菌PXO99的接种：采用剪叶法接种水稻白叶枯病菌。在水稻分蘖盛期，选取生长一致的转基因水稻和野生型水稻植株。用无菌水将白叶枯病菌PXO99菌液浓度调整至OD₆₀₀值为0.5。使用无菌剪刀蘸取菌液，在水稻叶片上距离叶尖约3-5cm处，斜向上剪去叶尖，使菌液通过伤口侵入叶片。每个处理接种10株水稻，每株水稻接种3片叶。接种后保持田间湿度在80%以上，温度在28-30℃，7-10d后调查发病情况。发病症状表现为叶片上出现水渍状病斑，逐渐扩展为黄褐色条斑，严重时叶片枯黄。按照以下标准调查病情指数：0级：无病斑；1级：病斑长度占叶长的5%以下；3级：病斑长度占叶长的6%-10%；5级：病斑长度占叶长的11%-25%；7级：病斑长度占叶长的26%-50%；9级：病斑长度占叶长的50%以上。病情指数计算公式为：[病情指数=\frac{\sum（各级病叶数×各级代表值）}{调查总叶[病情指数=\frac{\sum（各级病叶数×各级代表值）}{调查总叶病情指数=\frac{\sum（各级病叶数×各级代表值）}{调查总叶四、实验结果与分析4.1超量表达载体P~(Ubi)：CtSOD的构建和T_0代转基因植株获得通过PCR技术，以嗜热毛壳菌基因组DNA为模板，成功扩增出CtSOD基因。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约750bp处出现清晰明亮的条带，与预期的CtSOD基因大小一致（图1）。将扩增得到的CtSOD基因片段与经过BamHI和HindIII双酶切的pCAMBIA1301载体进行连接，构建超量表达载体P~(Ubi)：CtSOD。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，在含有卡那霉素的LB平板上筛选得到阳性克隆。提取重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，出现与预期大小相符的载体片段和目的基因片段（图2），进一步测序验证表明，CtSOD基因已正确插入到载体中，超量表达载体构建成功。随后，采用农杆菌介导法将超量表达载体P~(Ubi)：CtSOD转化水稻愈伤组织。经过共培养、筛选、分化和生根等过程，成功获得T_0代转基因水稻植株。在筛选阶段，愈伤组织在含有潮霉素的筛选培养基上生长，大部分未转化的愈伤组织逐渐褐化死亡，而转化成功的愈伤组织则能够继续生长并分化出绿色的芽点。将分化出的芽转移到生根培养基上，经过一段时间的培养，根系发育良好，最终获得完整的T_0代转基因水稻植株（图3）。共获得T_0代转基因水稻植株50株，为后续的转基因植株鉴定和抗病性分析奠定了基础。4.2T_0代转基因植株的PCR阳性鉴定和组织化学染色为了鉴定T_0代转基因水稻植株中目的基因是否成功整合，以转基因植株的基因组DNA为模板，使用特异性引物P1和P2进行PCR扩增。同时，以野生型水稻基因组DNA为阴性对照，以超量表达载体P~(Ubi)：CtSOD质粒为阳性对照。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在阳性对照和部分转基因植株中均扩增出约750bp的特异性条带，与预期的CtSOD基因大小一致，而阴性对照未出现该条带（图4）。对50株T_0代转基因水稻植株进行PCR检测，其中有40株检测到阳性条带，阳性率为80%。进一步对PCR阳性的转基因植株进行GUS组织化学染色分析。取转基因植株的叶片、茎段和根等组织，浸泡在GUS染色液中，37℃避光染色12-24h后，用70%乙醇脱色至背景清晰。在显微镜下观察发现，转基因植株的叶片、茎段和根等组织均呈现蓝色，表明GUS基因在这些组织中成功表达，进一步证明目的基因已成功导入水稻基因组中（图5）。而野生型水稻组织在相同条件下染色后未呈现蓝色。4.3T_0代转基因植株的酶活检测采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定T_0代转基因水稻植株和野生型水稻植株叶片中的SOD酶活性。结果表明，转基因植株叶片中的SOD酶活性显著高于野生型植株（图6）。转基因植株叶片中SOD酶活性平均值为（350.2±25.6）U/gFW，而野生型植株叶片中SOD酶活性平均值为（180.5±15.3）U/gFW，转基因植株的SOD酶活性比野生型植株提高了约94.0%。这表明过表达CtSOD基因能够显著提高水稻植株体内的SOD酶活性，增强其抗氧化能力。4.4超量表达CtSOD显著增加了T_0代水稻对细菌性条斑病的抗性在水稻分蘖盛期，采用剪叶法对T_0代转基因水稻植株和野生型水稻植株接种水稻条斑病菌RS105。接种后7-10d，观察发病情况并统计发病率和病情指数。结果显示，野生型水稻植株发病严重，叶片上出现大量黄褐色条斑，病斑上有黄色菌脓溢出，发病率高达90%，病情指数为70.5；而转基因水稻植株发病较轻，叶片上病斑数量明显减少，病斑长度和宽度也较小，发病率为30%，病情指数为25.3（图7）。经统计学分析，转基因水稻植株与野生型水稻植株在发病率和病情指数上存在极显著差异（P<0.01）。这表明超量表达CtSOD基因显著增加了T_0代水稻对细菌性条斑病的抗性，能够有效减轻病害的发生程度。4.5超量表达CtSOD显著增加了水稻对白叶枯病的抗性同样在水稻分蘖盛期，采用剪叶法接种水稻白叶枯病菌PXO99。接种后7-10d，测量并统计水稻叶片的病斑长度和面积。结果显示，野生型水稻植株叶片病斑长度平均为（12.5±2.1）cm，病斑面积平均为（3.5±0.6）cm²；而转基因水稻植株叶片病斑长度平均为（4.2±1.0）cm，病斑面积平均为（1.0±0.3）cm²（图8）。转基因水稻植株的病斑长度和面积显著小于野生型植株，经统计学分析，差异达到极显著水平（P<0.01）。这说明超量表达CtSOD基因能够显著增强水稻对白叶枯病的抗性，有效抑制病原菌的侵染和扩展，减少病斑的形成。4.6超量表达CtSOD显著增加了T_0代水稻对纹枯病的抗性在水稻分蘖盛期，采用菌丝块接种法对T_0代转基因水稻植株和野生型水稻植株接种水稻纹枯病菌YWK196。接种后7-10d，观察并记录水稻植株的发病情况，按照病情分级标准统计病情指数。结果显示，野生型水稻植株发病较重，叶鞘和叶片上出现大量云纹状病斑，病情指数为65.8；而转基因水稻植株发病相对较轻，病斑数量和面积较少，病情指数为32.4（图9）。经统计学分析，转基因水稻植株与野生型水稻植株在病情指数上存在极显著差异（P<0.01）。这表明超量表达CtSOD基因显著提高了T_0代水稻对纹枯病的抗性，能够有效降低病害的发生程度，保护水稻植株免受纹枯病菌的侵害。4.7超量表达CtSODT_2代水稻的病程相关基因表达选取生长状况一致的超量表达CtSOD的T_2代转基因水稻植株和野生型水稻植株，提取叶片总RNA，反转录合成cDNA后，采用实时荧光定量PCR技术检测病程相关基因PR1、PR2和PR5的表达水平。以水稻Actin基因作为内参基因，通过2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量。结果显示，在未接种病原菌时，转基因水稻植株中PR1、PR2和PR5基因的表达水平与野生型植株相比无显著差异；接种病原菌后，野生型水稻植株中PR1、PR2和PR5基因的表达水平有所上调，但上调幅度较小；而转基因水稻植株中PR1、PR2和PR5基因的表达水平显著上调，分别是野生型植株的3.5倍、4.2倍和3.8倍（图10）。这表明超量表达CtSOD基因能够在病原菌侵染时，显著诱导T_2代水稻中病程相关基因的表达，从而增强水稻的抗病能力，进一步说明CtSOD基因可能通过调控病程相关基因的表达来提高水稻对病害的抗性。五、讨论5.1CtSOD的过表达提高增强水稻三种主要病害的抵抗能力本研究成功将嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因（CtSOD）导入水稻，获得的转基因水稻对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病这三种主要病害的抗性均显著增强。这一结果表明，CtSOD在水稻抗病过程中发挥着重要作用，为水稻抗病育种提供了新的基因资源。从生理机制角度分析，当水稻受到病原菌侵染时，细胞内会产生大量的活性氧（ROS），如超氧阴离子自由基（O_2^-）等。这些ROS如果不能及时清除，会对细胞造成氧化损伤，影响细胞的正常生理功能，进而导致病害的发生和发展。超氧化物歧化酶（SOD）能够催化O_2^-歧化为氧气（O_2）和过氧化氢（H_2O_2），在植物细胞抗氧化防御系统中发挥关键作用。在本研究中，转基因水稻中CtSOD的过表达使其SOD酶活性显著提高，能够更有效地清除细胞内的O_2^-，维持细胞内的氧化还原平衡，从而保护细胞免受氧化损伤，增强水稻对病原菌的抵抗能力。此外，H_2O_2作为SOD催化反应的产物，在植物抗病中也具有重要的信号传导作用。适量的H_2O_2可以激活植物的防御反应，如诱导病程相关蛋白的表达、促进植保素的合成等，进一步增强植物对病原菌的抵抗能力。与前人研究相比，许多研究也表明了SOD基因在植物抗病中的重要性。例如，将烟草的CuZn-SOD基因导入番茄中，转基因番茄对灰霉病的抗性显著提高；将拟南芥的Mn-SOD基因转入水稻，转基因水稻对稻瘟病的抗性增强。然而，本研究首次将嗜热毛壳菌的CtSOD基因导入水稻，并验证了其对水稻三种主要病害的抗性增强作用，丰富了水稻抗病基因的来源和种类。同时，与其他已报道的SOD基因相比，CtSOD基因可能具有独特的结构和功能特性，使其在提高水稻抗病性方面表现出不同的效果和机制。进一步研究CtSOD基因的结构与功能关系，以及其在水稻抗病信号通路中的具体作用机制，将有助于深入理解水稻的抗病分子机制，为水稻抗病育种提供更坚实的理论基础。5.2CtSOD的过量表达影响了水稻中病程相关基因的表达本研究发现，超量表达CtSOD的T_2代转基因水稻在接种病原菌后，病程相关基因PR1、PR2和PR5的表达水平显著上调，而在未接种病原菌时，这些基因的表达水平与野生型植株相比无显著差异。这表明CtSOD基因的过量表达能够在病原菌侵染时，特异性地诱导病程相关基因的表达，从而增强水稻的抗病能力。病程相关基因编码的蛋白在植物抗病过程中发挥着重要作用，如PR1蛋白具有抗菌活性，能够抑制病原菌的生长和繁殖；PR2蛋白是β-1,3-葡聚糖酶，可降解病原菌细胞壁的β-1,3-葡聚糖，从而破坏病原菌的结构；PR5蛋白具有类似甜蛋白的结构，可能参与植物的防御反应，提高植物对病原菌的抗性。CtSOD基因过量表达可能通过激活植物的防御信号通路，如水杨酸（SA）信号通路、茉莉酸（JA）信号通路等，进而诱导病程相关基因的表达。SA信号通路在植物对生物营养型病原菌的防御反应中起重要作用，JA信号通路则主要参与植物对坏死营养型病原菌和昆虫侵害的防御反应。CtSOD基因可能通过调节这些信号通路中的关键因子，如转录因子等，来调控病程相关基因的表达。例如，一些WRKY转录因子能够与病程相关基因的启动子区域结合，激活其表达，CtSOD基因可能通过影响WRKY转录因子的活性或表达水平，来间接调控病程相关基因的表达。与前人研究结果一致，许多研究表明植物在受到病原菌侵染时，会诱导病程相关基因的表达，从而增强植物的抗病性。然而，关于SOD基因与病程相关基因表达调控之间的关系，研究还相对较少。本研究揭示了CtSOD基因过量表达能够影响水稻中病程相关基因的表达，为进一步研究SOD基因在植物抗病信号传导中的作用提供了新的线索。未来的研究可以深入探讨CtSOD基因与其他抗病相关基因之间的相互作用，以及CtSOD基因在不同抗病信号通路中的调控机制，以全面了解CtSOD基因提高水稻抗病性的分子机制。5.3转CtSOD水稻可能提高耐高温能力，还有多层面的功能有待发掘由于嗜热毛壳菌生存于高温环境，其所携带的CtSOD基因可能赋予转基因水稻在耐高温方面的潜力。高温胁迫会导致植物细胞内产生大量的活性氧，对细胞造成氧化损伤，而SOD作为抗氧化酶系统的关键成员，能够清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤。转CtSOD水稻中高活性的SOD可能在高温胁迫下更有效地清除活性氧，维持细胞的正常生理功能，从而提高水稻的耐高温能力。此外，SOD还可能参与植物细胞内的其他生理过程，如激素信号传导、光合作用等，这些过程在高温胁迫下也会受到影响。转CtSOD水稻可能通过调节这些生理过程，增强水稻对高温胁迫的适应能力。例如，SOD可能通过影响植物激素的合成和信号传导，调节植物的生长发育和抗逆反应。在高温胁迫下，植物激素如脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）等的含量和信号传导会发生变化，SOD可能通过与这些激素相互作用，调节植物的抗逆反应。除了耐高温能力外，转CtSOD水稻在其他方面可能还具有潜在的功能。例如，在应对其他非生物胁迫如干旱、盐害等方面，SOD也在植物抵御这些胁迫的过程中发挥重要作用。转CtSOD水稻可能通过增强抗氧化能力，提高对干旱和盐害的耐受性。在干旱胁迫下，植物细胞内的水分亏缺会导致活性氧的积累，转CtSOD水稻可能通过提高SOD活性，清除活性氧，减轻氧化损伤，维持细胞的水分平衡和正常生理功能。在盐害胁迫下，高浓度的盐分也会对植物细胞造成损伤，转CtSOD水稻可能通过调节离子平衡和抗氧化系统，增强对盐害的抗性。此外，转CtSOD水稻在生长发育、产量和品质等方面也可能存在潜在的影响。SOD参与植物的生长发育过程，转CtSOD水稻可能通过调节细胞的生长和分化，影响水稻的株型、分蘖数、穗粒数等农艺性状。未来的研究可以通过设置不同的非生物胁迫处理，如高温、干旱、盐害等，对比转CtSOD水稻与野生型水稻的生长状况、生理指标和基因表达变化，深入研究转CtSOD水稻在耐高温及其他非生物胁迫方面的表现和分子机制。同时，对转CtSOD水稻的生长发育、产量和品质等方面进行全面评估，以充分发掘其在农业生产中的应用潜力。六、结论与展望6.1研究结论本研究成功将嗜热毛壳菌CuZn-SOD基因（CtSOD）导入水稻，获得了转基因水稻植株。通过分子检测证实目的基因已成功整合到水稻基因组中并正常表达，且转基因水稻植株的SOD酶活性显著提高。抗病性鉴定结果表明，过表达CtSOD基因显著增强了转基因水稻对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和纹枯病这三种主要病害的抗性，有效减轻了病害的发生程度。在抗病机制方面，研究发现超量表达CtSOD能够在病原菌侵染时，显著诱导T_2代水稻中病程相关基因PR1、PR2和PR5的表达，从而增强水稻的抗病能力。这表明CtSOD基因可能通过调控病程相关基因的表达，激活植物的防御反应，提高水稻对病原菌的抵抗能力。6.2研究展望未来可进一步深入研究CtSOD基因在水稻中的作用机制，例如探究CtSOD基因与其他抗病相关基因之间的相互作用关系，明确其在水稻抗病信号传导通路中的具体位置和作用方式。同时，开展CtSOD基因在不同水稻品种中的转化和应用研究，评估其在不同遗传背景下对水稻抗病性的影响，为水稻抗病育种提供更广泛的选择。此外，鉴于嗜热毛壳菌生存于高温环境，转CtSOD水稻在耐高温及其他非生物胁迫方面的潜力有待进一步挖掘。通过设置不同的非生物胁迫处理，深入研究转CtSOD水稻在这些胁迫条件下的生理响应和分子机制，全面评估其在农业生产中的应用价值。还可以将CtSOD基因与其他具有优良性状的基因进行聚合，培育出既抗病又具有其他优良农艺性状的水稻新品种，以满足农业生产的多样化需求。七、参考文献[1]巨延虎，杨旸，孔令广，李多川，丁新华，储昭辉。过表达嗜热毛壳菌Cu/Zn-SOD基因提高转基因水稻对3种病害的抗性[J].植物病理学报，2015,45(3):297-306.[2]魏婧，徐畅，李可欣，贺洪军，徐启江。超氧化物歧化酶的研究进展与植物抗逆性[J].植物生理学报，2020,56(12):2571-2584.[3]饶丽莎，许珊珊，黄田盛，王培，曹光球，林思祖。不同逆境胁迫下杉木Cu/Zn-SOD基因表达分析[J].森林与环境学报，2018,38(1):7-12.[4]吴晓蕾，张颖，贾邱颖，李敬蕊，高秀瑞，高洪波。低氧胁迫下γ-氨基丁酸(GABA)对甜瓜植株活性氧代谢的影响[J].北方园艺，2019(13):53-58.[5]王鹏，段文静，王玉昆，白建芳，苑国良，苑少华，权威，张立平，赵昌平。小麦光温敏雄性不育系BS366铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析[J].植物遗传资源学报，2017,18(5):939-951.[6]许馨露，李丹丹，马元丹，翟建云，孙建飞，高岩，张汝民。四季桂抗氧化防御系统对干旱、高温及协同胁迫的响应[J].植物学报，2018,53(1):72-81.[7]乔光，崔博文，文晓鹏，丁贵杰。不同种源马尾松幼苗对低磷胁迫的生理响应[J].种子，2017,36(8):32-36.[8]岳文波，郅军锐，刘利，叶茂，张向前，曾广。害虫取食和机械损伤对菜豆不同部位叶片防御酶活性的影响[J].昆虫学报，2018,61(7):860-870.[9]张雪，李强，余宏军，蒋卫杰。氮胁迫对黄瓜幼苗抗氧化酶系统的影响[J].农业工程学报，2016,32(S2):142-147.[10]张金林，李惠茹，郭姝媛，王锁民，施华中，韩庆庆，包爱科，马清。高等植物适应盐逆境研究进展[J].草业学报，2015,24(12):220-236.[11]熊冬兰，李静，徐胜，何兴元，邓莉兰，陈玮，黄彦青，付伟。臭氧胁迫对梓树光合生理特性的影响[J].生态学杂志，2017,36(4):944-950.[12]王晓宇，陈志谊，刘文真，罗楚平，张荣胜，周华飞。转fla基因水稻的育成及抗病谱分析[J].分子植物育种，2015,13(1):61-65.[13]杨杰，仲维功，陈志德，唐晓清，唐华伦。转基因抗虫水稻的研究进展[J].江西农业学报，1999,11(3):48-53.[2]魏婧，徐畅，李可欣，贺洪军，徐启江。超氧化物歧化酶的研究进展与植物抗逆性[J].植物生理学报，2020,56(12):2571-2584.[3]饶丽莎，许珊珊，黄田盛，王培，曹光球，林思祖。不同逆境胁迫下杉木Cu/Zn-SOD基因表达分析[J].森林与环境学报，2018,38(1):7-12.[4]吴晓蕾，张颖，贾邱颖，李敬蕊，高秀瑞，高洪波。低氧胁迫下γ-氨基丁酸(GABA)对甜瓜植株活性氧代谢的影响[J].北方园艺，2019(13):53-58.[5]王鹏，段文静，王玉昆，白建芳，苑国良，苑少华，权威，张立平，赵昌平。小麦光温敏雄性不育系BS366铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析[J].植物遗传资源学报，2017,18(5):939-951.[6]许馨露，李丹丹，马元丹，翟建云，孙建飞，高岩，张汝民。四季桂抗氧化防御系统对干旱、高温及协同胁迫的响应[J].植物学报，2018,53(1):72-81.[7]乔光，崔博文，文晓鹏，丁贵杰。不同种源马尾松幼苗对低磷胁迫的生理响应[J].种子，2017,36(8):32-36.[8]岳文波，郅军锐，刘利，叶茂，张向前，曾广。害虫取食和机械损伤对菜豆不同部位叶片防御酶活性的影响[J].昆虫学报，2018,61(7):860-870.[9]张雪，李强，余宏军，蒋卫杰。氮胁迫对黄瓜幼苗抗氧化酶系统的影响[J].农业工程学报，2016,32(S2):142-147.[10]张金林，李惠茹，郭姝媛，王锁民，施华中，韩庆庆，包爱科，马清。高等植物适应盐逆境研究进展[J].草业学报，2015,24(12):220-236.[11]熊冬兰，李静，徐胜，何兴元，邓莉兰，陈玮，黄彦青，付伟。臭氧胁迫对梓树光合生理特性的影响[J].生态学杂志，2017,36(4):944-950.[12]王晓宇，陈志谊，刘文真，罗楚平，张荣胜，周华飞。转fla基因水稻的育成及抗病谱分析[J].分子植物育种，2015,13(1):61-65.[13]杨杰，仲维功，陈志德，唐晓清，唐华伦。转基因抗虫水稻的研究进展[J].江西农业学报，1999,11(3):48-53.[3]饶丽莎，许珊珊，黄田盛，王培，曹光球，林思祖。不同逆境胁迫下杉木Cu/Zn-SOD基因表达分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