ISO 20397-32025 生物技术 大规模平行测序 第3部分宏基因组学的一般要求和指南标准立项发展报告

生物技术大规模平行测序第3部分：宏基因组学的一般要求和指南标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part3:Generalrequirementsandguidanceformetagenomics摘要随着高通量测序技术的飞速发展，大规模平行测序（MassivelyParallelSequencing,MPS）已从基础科研工具演变为广泛应用于临床诊断、公共卫生监测、环境生态评估和食品安全等多个领域的关键技术。其中，宏基因组学作为直接对复杂样本中全部遗传物质进行测序分析的新兴学科，在病原体识别、微生物群落结构解析和功能基因挖掘等方面展现出不可替代的优势。然而，由于样本处理流程复杂、生物信息学分析路径多样、质量控制标准缺失，宏基因组学检测结果在不同实验室之间往往缺乏可比性和可重复性。为应对上述挑战，国际标准化组织（ISO）于2025年7月正式发布了ISO20397-3:2025《生物技术大规模平行测序第3部分：宏基因组学的一般要求和指南》。本标准作为ISO20397系列标准的重要组成部分，系统性地规定了宏基因组学实验设计、样本采集与处理、文库构建、测序实施、数据分析及结果报告的全流程一般要求和操作指南。本报告系统梳理了该标准的立项背景、编制原则、核心技术内容及其预期应用价值，旨在为标准实施推广和相关领域标准化工作提供参考依据。关键词：大规模平行测序；宏基因组学；国际标准；质量控制；生物技术标准化；高通量测序Keywords:Massivelyparallelsequencing;Metagenomics;Internationalstandard;Qualitycontrol;Biotechnologystandardization;High-throughputsequencing一、引言1.1宏基因组学技术发展与标准化需求宏基因组学（Metagenomics）是指对环境或临床样本中的混合基因组DNA进行直接提取、测序和分析的技术方法，无需对微生物进行分离培养。自2004年Venter等人通过鸟枪法测序完成马尾藻海宏基因组研究以来，该技术经历了从克隆文库构建到高通量测序直接分析的革新性转变。近年来，随着测序成本的指数级下降和测序通量的持续提升，宏基因组学已从探索性研究快速走向临床应用和产业实践。在临床领域，宏基因组下一代测序（mNGS）已被证明在不明原因感染、罕见病原体诊断和混合感染检测中具有显著优势；在公共卫生领域，宏基因组学成为新发传染病病原体早期识别和疫情溯源的核心技术平台；在环境监测与食品安全领域，宏基因组学为微生物风险评估提供了全新的技术路径。然而，技术的快速应用也暴露出标准化缺失带来的突出问题：不同实验室在样本处理、核酸提取、建库策略和生物信息学分析等环节的流程差异，导致检测结果的灵敏度、特异性和可重复性参差不齐。1.2ISO/TC276与ISO20397系列标准沿革国际标准化组织于2013年成立了生物技术标准化技术委员会（ISO/TC276），致力于制定涵盖生物技术全产业链的国际化标准体系。作为该技术委员会的核心标准之一，ISO20397系列标准聚焦于大规模平行测序技术的规范化：-ISO20397-1:2022规定了大规模平行测序的核酸提取和质量评估要求；-ISO20397-2:2023规定了大规模平行测序的文库构建和质量评估要求；-ISO20397-3:2025即本报告所述标准，聚焦于宏基因组学应用的特殊要求和实施指南。得益于前两部分标准打下的坚实基础，ISO20397-3作为系列标准的第三个组成部分，重点解决宏基因组学应用中区别于常规MPS流程的特殊技术难点和质量管理需求。1.3标准立项背景在ISO/TC276的工作框架下，来自中国、美国、德国、日本、韩国等成员体的专家经过多轮研讨，一致认识到宏基因组学领域迫切需要建立统一的国际标准。现行的各国指导文件，如美国CDC的mNGS验证指南、中国《宏基因组测序病原微生物检测技术规范》等，虽各有价值但缺乏国际层面的统一性和互认基础。在此背景下，ISO20397-3:2025的制定工作正式启动，旨在填补宏基因组学国际标准的空白，为全球范围内宏基因组学技术的规范应用和质量保障提供权威技术支持。二、标准编制概况2.1编制原则ISO20397-3:2025在编制过程中遵循了以下核心原则：（1）科学性原则：标准内容以宏基因组学领域的最新科学研究成果为技术依据，充分反映了当前行业的最佳实践和技术共识。（2）协调性原则：与ISO20397-1和ISO20397-2保持技术逻辑的一致性，同时与ISO15189（医学实验室质量与能力要求）、ISO/IEC17025（检测和校准实验室能力的通用要求）等质量管理体系标准相衔接。（3）实用性原则：充分考虑不同应用场景和技术平台的多样性，在统一要求的框架下为不同类型的实验室提供可操作的指导。（4）前瞻性原则：既立足当前主流技术路线，又兼顾技术发展的趋势，为未来新方法、新平台的纳入留有空间。2.2编制过程该标准的编制工作经历了标准提案（NP）、工作组草案（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）等各阶段严格的审查程序。来自全球多个成员体的专家组围绕宏基因组学全流程中的关键质量控制节点进行了多轮深入研讨，最终于2025年7月形成正式发布版本。2.3标准定位ISO20397-3:2025定位为宏基因组学实验操作和质量管理的基础性技术标准，适用于以下应用场景：-临床感染性疾病的病原体宏基因组检测；-环境微生物群落的结构与功能分析；-食品微生物安全的风险评估与溯源；-工业生物技术中的微生物群落监测。该标准的核心目标是保障宏基因组学检测结果的可靠性、可重复性和可比性，从而促进宏基因组学技术在全球范围内的规范应用与结果互认。三、标准主要内容解析3.1术语与定义标准对宏基因组学领域的核心术语进行了规范化定义，主要包括以下内容：-宏基因组学：不经分离培养，直接对样本中的混合基因组DNA/RNA进行测序分析的技术方法；-宏基因组下一代测序：基于大规模平行测序平台的宏基因组分析方法；-宿主背景：临床或环境样本中非目标微生物来源的核酸总含量；-读长：测序仪单次读取产生的核酸序列长度；-覆盖度：测序获得的总碱基数与目标基因组大小的比值；-操作分类单元：基于序列相似性聚类划分的微生物分类学单元。这些统一定义为全球范围内的技术交流和数据比较提供了共同语言基础。3.2实验设计的一般要求标准要求实验室在开展宏基因组学检测前应进行充分的实验设计，包括但不限于：-检测目的明确化：清晰定义检测目标（如广谱病原体筛查、特定微生物定量分析或群落结构比较）；-方法学验证：在正式投入使用前，实验室应对宏基因组学检测流程进行充分的方法学验证，验证内容涵盖灵敏度、特异性、重复性、再现性及抗干扰能力等关键性能指标，并明确各性能指标的验证方法和可接受标准；-阳性和阴性对照的设置：在方法学验证及后续常规检测中明确要求设置阳性对照、阴性对照和空白对照的具体数量和类型；-样本量估算：根据检测目的和分析方法的统计学要求，合理估算所需样本数量；-生物信息学流程的预定义：在实验启动前明确序列比对数据库、生物信息学分析流程版本及物种分类学判定标准。3.3样本采集、运输与保存样本质量直接决定宏基因组学检测结果的可靠性，标准在样本全流程管理方面作出了具体规定：样本采集环节，标准要求根据检测目的选择合适的样本类型，采集过程中应严格避免外源微生物污染，并使用无核酸酶、无菌的采集容器。涉及不同微生物丰度的样本类型，应按照标准规定的优先级进行选择。运输环节，标准根据不同样本类型推荐了相应的保存温度和最长运输时限。对于RNA病毒检测的样本，应特别关注防止核酸降解的冷链条件。保存环节，标准规定了不同条件下样本的保存时限：冷藏样本（2–8°C）、冷冻样本（-20°C及以下）和超低温样本（-70°C及以下）分别对应不同的最长保存周期。所有样本应记录完整的采集时间、采集部位、保存条件等信息。3.4核酸提取与质量评估核酸提取是宏基因组学检测流程中变异性最大的环节之一。标准从以下方面进行了规范：-破壁策略：根据不同微生物类型（革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等）的细胞壁结构差异，推荐采用机械破壁（如珠磨法）、酶解破壁或化学裂解等方法组合，以提高复杂样本中微生物核酸的提取效率；-宿主核酸去除：对于宿主背景较高的临床样本（如全血、组织），标准推荐了差异裂解法、探针捕获法等宿主核酸去除策略，并要求记录去除效率和残留宿主核酸水平；-核酸质量评估：明确了DNA/RNA的纯度（A260/A280比值）、完整性和浓度的评估方法及可接受标准；-内参添加：建议在核酸提取前加入已知序列的外源内参，用于监测提取效率和后续检测流程的全程质控。3.5文库构建与测序在文库构建环节，标准重点关注以下方面：-文库类型选择：根据检测目标（DNA宏基因组vs.RNA宏基因组/转录组）推荐相应的文库构建策略；-扩增偏差控制：对于需要进行PCR扩增的流程，规定了最适循环数和扩增酶选择要求，以降低扩增偏差对微生物丰度定量的影响；-接头连接效率：规定了接头连接效率的最低要求及评估方法；-文库质量控制：明确了文库浓度、片段分布、接头二聚体残留等指标的评估方法及合格标准。在测序实施方面，标准对测序深度和读长选择提出了具体建议，根据不同应用场景推荐了最低测序数据量和推荐的读长类型。同时，标准要求每次测序运行应包含适当的阳性对照（如已知组成的模拟微生物群落）和阴性对照文库。3.6生物信息学分析生物信息学分析是宏基因组学区别于传统检测方法的核心环节，也是结果差异的主要来源。标准对此作出了系统性规范：原始数据处理方面，标准对下机数据的质量评估参数（Q值分布、GC含量分布、重复序列比例等）、低质量数据过滤标准及接头去除流程提出了明确要求。宿主序列去除方面，标准要求使用人类参考基因组（或其他宿主参考基因组）进行序列比对和过滤，并记录宿主序列所占比例。微生物鉴定与定量方面，标准对分类学数据库的选择和版本管理、序列比对算法的参数设定、物种分类学判定阈值（如属水平、种水平）以及相对丰度和绝对丰度的计算方法提出了规范性要求。结果解读和报告方面，标准要求明确区分“检出”和“未检出”的判断标准，建议报告检出微生物的序列数、覆盖度、相对丰度等指标，并要求在报告中注明方法的检出限、局限性及可能的假阳性和假阴性风险因素。3.7质量控制与质量保证标准构建了覆盖宏基因组学检测全流程的质量控制体系：-实验室环境监测：定期进行实验室环境和试剂的微生物污染监测；-批间质控：使用标准微生物组合（人工模拟群落）进行批间质量评估，追踪检测结果的稳定性和趋势变化；-人员能力：对从事宏基因组学检测的人员提出专业知识、操作技能和持续培训的要求；-外部质量评价：建议实验室定期参加能力验证或室间质量评价计划；-数据可追溯性：要求完整记录检测流程中的关键参数、试剂批次和仪器信息，确保数据的可追溯性。四、主要参与单位ISO20397-3:2025的编制过程汇集了全球多个成员体和组织的专家力量。作为生物技术标准化的重要参与方之一，中国食品药品检定研究院（NationalInstitutesforFoodandDrugControl,NIFDC）在标准研制过程中发挥了关键作用。中国食品药品检定研究院是国家药品监督管理局直属的事业单位，是国家检验药品、生物制品、医疗器械和食品添加剂质量的法定机构和最高技术仲裁机构。该研究院下设的体外诊断试剂与生物材料检定所长期从事体外诊断试剂的质量评价和标准化研究，在高通量测序技术的标准化领域积累了丰富经验。在ISO20397-3的编制过程中，中国食品药品检定研究院的专家团队主要负责和参与了以下核心工作：-核酸提取与质量评估部分的草案起草，贡献了基于多类型临床样本的大规模验证数据；-生物信息学分析环节中有关数据库构建和物种鉴定判定的技术方案，推动建立了统一的分类学判定逻辑框架；-组织国内多家临床检验机构和第三方医学检验所开展了标准草案的适用性验证研究，为标准的可行性和可操作性提供了详实的数据支撑；-协调国内宏基因组学领域的产学研资源，在标准研制过程中充分反映了新兴技术应用大国的实际需求。此外，美国国家标准学会（ANSI）、德国标准化协会（DIN）、日本工业标准调查会（JISC）等成员体也在标准的多个技术章节中贡献了重要力量。来自国际临床化学联合会（IFCC）和国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM）的专家也为标准中有关量值溯源和质量评价的内容提供了专业指导。五、标准的应用价值与影响5.1对临床诊断领域的意义ISO20397-3:2025为临床宏基因组检测（mNGS）的规范开展提供了国际统一的技术基准。该标准的发布将有力推动mNGS检测技术从“各自为政”走向“规范统一”，有助于提升感染性疾病诊断的准确性和不同医疗机构之间检测结果的可比性。特别是在不明原因发热、疑难感染和新发突发传染病的诊断中，标准化流程的建立将显著改善诊断效率和患者预后。5.2对公共卫生监测的影响在公共卫生领域，该标准为基于宏基因组学的病原体监测和预警体系提供了统一的技术框架。无论是环境污水监测、动物疫病监测还是出入境检验检疫，标准化流程的采用将极大提高不同监测网络之间数据的可比性和整合效率，增强对传染病暴发的早期识别和响应能力。5.3对生态学和环境科学研究的推动宏基因组学在环境微生物群落研究中的应用日益广泛。该标准的发布为环境宏基因组学研究的设计、实施和数据汇报提供了统一参考，将显著提升不同研究之间结果的可比性和研究结论的可靠性，促进全球环境微生物组数据的整合与共享。5.4对行业发展的促进对于体外诊断企业、测序服务提供商和生物信息学软件开发企业而言，该标准提供了明确的产品研发和质量控制导向，有助于降低产品开发和市场准入的不确定性，促进行业的良性竞争和健康发展。六、结论与展望ISO20397-3:2025作为国际标准化组织在生物技术领域发布的又一项重要标准，填补了宏基因组学国际标准化的空白。该标准的发布标志着大规模平行测序标准化体系在宏基因组学维度上的重要拓展，对于推动宏基因组学技术的规范化应用和全球化发展具有重要意义。从技术角度看，该标准系统性地覆盖了宏基因组学检测的全流程，从实验设计、样本处理到数据分析提供了全面的要求和指导。从应用角度看，标准的实施将有效提高宏基因组学检测结果在不同实验室、不同平台之间的可比性和互认性，降低技术应用的质量风险。从产业角度看，该标准为宏基因组学相关产品和服务提供了明确的质量基准，有利于规范市场秩序和促进技术创新。展望未来，随着三代测序技术（如纳米孔测序）在宏基因组学中的应用不断深入、单细胞宏基因组学和培养组学等新技术的蓬勃发展，以及人工智能和云计算在生物信息学分析中的深度渗透，宏基因组学标准化工作将面临新的挑战。ISO20397系列标准需要在保持基础框架稳定的同时持续动态更新，适时启动修订或补充标准的制定工作。同时，应加强标准在全球各国和地区的宣贯实施，推动标准在临床实验室认可、体外诊断产品注册和公共卫生实验室能力建设中的实质性应用。参考文献[1]ISO20397-3:2025,Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part3:Generalrequirementsandguidanceformetagenomics[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2025