ISO 20397-22021 生物技术大规模并行测序第2部分测序数据的质量评价标准立项发展报告

生物技术大规模并行测序第2部分：测序数据的质量评价标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Qualityevaluationofsequencingdata摘要随着高通量测序技术（即大规模并行测序，MassivelyParallelSequencing,MPS）在生命科学研究和临床精准医疗中的广泛应用，海量测序数据的质量评价已成为影响检测结果可靠性、可比性和可重复性的关键环节。为应对这一全球性技术治理需求，国际标准化组织（ISO）于2021年2月正式发布了ISO20397-2:2021《生物技术大规模并行测序第2部分：测序数据的质量评价》。该标准作为ISO20397系列标准的重要组成部分，系统规定了测序数据质量评价的通用要求、评价指标、评价流程及结果报告规范，为全球范围内测序数据质量的标准化管控提供了技术依据。本报告全面梳理了该标准的立项背景、编制过程、核心技术内容、国内外应用现状及推广前景，并对该标准实施后对生物技术产业、临床检验领域和标准化体系建设所产生的深远影响进行了系统分析。报告指出，ISO20397-2:2021填补了国际标准化组织在大规模并行测序数据质量评价领域的技术标准空白，对于促进全球测序数据的互认互通、推动精准医学的规范化发展具有重要的里程碑意义，建议国内相关机构加快该标准的转化应用，并积极参与后续国际标准的修订与完善工作。关键词：大规模并行测序；测序数据；质量评价；国际标准；ISO20397；生物技术；标准化AbstractWiththewidespreadapplicationofhigh-throughputsequencingtechnology(MassivelyParallelSequencing,MPS)inlifescienceresearchandprecisionmedicine,thequalityevaluationofmassivesequencingdatahasbecomeacriticalfactoraffectingthereliability,comparability,andreproducibilityoftestingresults.Inresponsetothisglobaltechnicalgovernancechallenge,theInternationalOrganizationforStandardization(ISO)officiallyreleasedISO20397-2:2021"Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Qualityevaluationofsequencingdata"inFebruary2021.AsanimportantcomponentoftheISO20397series,thisstandardsystematicallyspecifiesthegeneralrequirements,evaluationindicators,evaluationprocedures,andresultreportingspecificationsforsequencingdataqualityevaluation,providingatechnicalbasisforstandardizedqualitymanagementofsequencingdataworldwide.Thisreportcomprehensivelyreviewstheprojectbackground,developmentprocess,coretechnicalcontent,applicationstatus,andpromotionprospectsofthestandard,andsystematicallyanalyzesthefar-reachingimpactofitsimplementationonthebiotechnologyindustry,clinicaltestingfields,andstandardizationsystemdevelopment.ThereportpointsoutthatISO20397-2:2021fillsthetechnicalstandardgapinthefieldofsequencingdataqualityevaluationwithintheInternationalOrganizationforStandardization,andisofmilestonesignificanceforpromotingglobalinteroperabilityofsequencingdataandadvancingthestandardizeddevelopmentofprecisionmedicine.Itisrecommendedthatrelevantdomesticinstitutionsacceleratetheadoptionandtransformationofthisstandardandactivelyparticipateinthefuturerevisionandimprovementofsubsequentinternationalstandards.Keywords:Massivelyparallelsequencing;Sequencingdata;Qualityevaluation;Internationalstandard;ISO20397;Biotechnology;Standardization一、引言1.1立项背景大规模并行测序技术（MassivelyParallelSequencing,MPS），又称下一代测序技术（Next-GenerationSequencing,NGS），自21世纪初问世以来，已彻底改变了生命科学研究和临床分子诊断的面貌。该技术能够在一次运行中对数百万乃至数十亿条DNA或RNA片段进行并行测序，从而以极高的通量和相对低廉的成本获取全基因组、全外显子组或目标区域的核酸序列信息。据不完全统计，截至2020年底，全球范围内累计安装的各类高通量测序平台已超过数万台套，测序数据产出量呈现指数级增长态势。然而，测序技术的迅猛发展也带来了一个日益突出的技术挑战——测序数据的质量控制问题。不同于传统的Sanger测序方法，大规模并行测序的整个流程涉及文库制备、模板扩增、芯片上机、碱基读取、数据比对和变异识别等多个复杂环节，每一环节的技术差异、试剂批次差异、操作人员差异以及仪器状态差异，均可能对最终产出的测序数据质量产生显著影响。如果缺乏统一的数据质量评价标准，不同实验室、不同平台、不同批次产生的测序数据之间将缺乏可比性，这直接制约了测序技术的临床转化应用和监管审批进程。在ISO20397-2:2021发布之前，尽管一些国际学术组织、行业协会和大型测序平台供应商曾各自发布过一些数据质量指南或建议，例如美国临床实验室标准化协会（CLSI）发布的分子诊断相关文件，但全球范围内尚缺乏一个由权威国际标准化组织发布的、适用于各技术平台的、系统全面的测序数据质量评价国际标准。这一标准化空白，严重制约了测序数据在国际范围内的互认与共享，也对临床测序检测的质量监管构成了挑战。1.2标准编制过程在此背景下，国际标准化组织ISO生物技术标准化技术委员会（ISO/TC276）于2015年前后正式启动了大规模并行测序系列国际标准的研制工作。ISO/TC276成立于2013年，是专门负责生物技术领域国际标准化工作的技术委员会，其工作范围涵盖生物技术研究、开发和应用中的术语、方法、流程及产品质量要求等方面。在ISO/TC276的组织协调下，来自中国、美国、德国、日本、韩国、英国、法国等多个国家的标准化专家共同参与了该系列标准的制定工作。ISO20397系列标准按照“总则—数据质量评价—数据分析”三个部分进行架构设计。其中，第1部分（ISO20397-1）规定了大规模并行测序的通用要求和基本流程，第2部分（ISO20397-2:2021）聚焦于测序数据的质量评价，第3部分则涉及数据分析的相关要求。经过多轮工作组讨论、草案征求意见、国际标准草案（DIS）投票和最终国际标准草案（FDIS）投票等标准制定程序，ISO20397-2:2021于2021年2月1日正式发布。1.3标准定位与意义ISO20397-2:2021是国际标准化组织首次针对大规模并行测序数据质量评价发布的专门性国际标准。该标准的发布标志着全球测序数据质量评价从各自为政的分散状态走向了统一规范的标准化阶段，为测序数据的国际互认和跨平台比较奠定了技术基础。该标准适用于各类大规模并行测序平台和多种应用场景，包括但不限于全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）、目标区域测序（TargetedSequencing）、转录组测序（RNA-Seq）、表观基因组测序等。无论是临床诊断实验室、科研服务机构、测序仪器和试剂生产商，还是药品监管部门和临床检验管理部门，均可参照该标准建立和实施测序数据质量评价体系。二、标准技术内容概述2.1标准适用范围与基本框架ISO20397-2:2021在适用范围上覆盖了大规模并行测序全过程产生的各类数据，包括原始数据（rawdata）、预处理数据（preprocesseddata）和最终分析结果数据。标准框架从质量评价的总体原则、评价指标的设定、评价流程的规范、质量控制参数的选择、质量评价结果的记录与报告等多个维度进行了系统规定。标准明确了测序数据质量评价的两大核心目标：一是确保测序数据能够满足预期用途的要求，即数据的充分性和适用性（fitnessforpurpose）；二是确保测序数据质量具有可追溯性和可比较性，即不同时间、不同批次、不同实验室产生的数据能够进行有意义的比较。2.2核心质量评价指标标准对测序数据质量评价所涉及的各项指标进行了系统分类和规范定义，主要包括以下几个维度：（1）碱基质量分数（BaseQualityScore）：标准规定了碱基质量分数（通常以Phred分数表示）的计算方法、记录格式和质量分级要求。Phred分数是测序领域通用的碱基准确度度量方式，其数值与碱基判读错误概率呈对数关系。标准明确了不同应用场景下对碱基质量分数的基本要求，以及质量分数在数据过滤和数据筛选中的使用方式。（2）测序深度与覆盖率（SequencingDepthandCoverage）：标准对测序深度（即平均每个碱基位点被测序读取的次数）、覆盖率（即目标区域内被有效测序覆盖的碱基比例）和均一性（即各区域测序深度的均匀程度）等参数给出了明确定义和评价方法。这些参数直接决定了测序数据在变异检测和定量分析中的灵敏度和可靠性。（3）比对质量指标（MappingQualityMetrics）：标准规定了测序读段（reads）比对到参考基因组后的质量评价指标，包括比对率（mappingrate）、唯一比对率（uniquelymappedrate）、错配率（mismatchrate）、插入缺失分布等。这些指标用于评估测序数据与参考序列的匹配质量，是判断数据是否存在污染、比对偏差或系统错误的重要依据。（4）文库复杂度与重复率（LibraryComplexityandDuplicationRate）：标准要求对测序数据中的PCR重复读段比例、文库复杂度等进行评价。高重复率往往意味着文库构建质量不佳或测序深度利用不充分，可能导致有效信息的损失和定量分析的偏差。（5）碱基组成分布与GC偏好性（BaseCompositionandGCBias）：标准提出了对测序读段各位置碱基组成分布的检查要求，以及对GC含量偏好性的评估方法。异常的碱基组成可能指示接头污染、扩增偏差或测序错误等质量问题。（6）错误率与噪音水平（ErrorRateandNoiseLevel）：标准规定了通过测序已知序列（如内参DNA、PhiX对照等）或利用序列间的一致性来评估测序系统错误率和噪音水平的方法。2.3质量评价流程ISO20397-2:2021系统地规范了测序数据质量评价的基本流程，主要包括以下几个关键步骤：（1）数据接收与完整性检查：对测序产生的原始数据文件进行格式合规性、文件完整性和元数据信息完整性检查；（2）基础质量统计：对原始数据进行碱基质量分数分布、碱基组成分布、读段长度分布和读段数量等基本质量参数进行统计分析；（3）深度与覆盖率评价：将测序读段比对至参考序列后进行深度和覆盖率及相关衍生参数的计算和评价；（4）系统性格差排查：通过多维度的质量控制图表和质量指标来识别测序过程中可能存在的系统性偏差或仪器故障；（5）质量综合评价与判定：根据预先设定的质量通过标准（acceptancecriteria），结合具体的应用场景要求，对测序数据的整体质量进行综合判定；（6）质量报告的编制与审核：按照标准要求编制规范化的质量评价报告，记录评价过程、评价指标和评价结论。2.4质量评价结果的报告要求标准对测序数据质量评价结果的记录和报告提出了明确要求。质量报告应至少包含以下核心要素：测序平台和仪器信息、试剂版本信息、样品信息和文库构建方法、测序运行参数、各质量评价指标的统计数据、质量判定结论、以及质量评价操作人员和分析软件版本信息等。这些信息对于实现测序数据的可追溯性、支持后续的数据审核和数据复现具有关键作用。2.5与相关标准的衔接ISO20397-2:2021在制定过程中注重与其他相关标准和规范文件的衔接与协调。在术语和定义方面，该标准与ISO20397-1保持一致，并参考了ISO16578等分子生物学检测相关标准的技术术语体系。在质量管理的总体框架方面，该标准与ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》和ISO15189《医学实验室质量和能力的要求》的原则相衔接，确保实验室在建立测序数据质量评价体系时能够与其既有的质量管理体系有效融合。三、主要编制单位介绍3.1国际标准化组织生物技术标准化技术委员会（ISO/TC276）ISO/TC276是负责制定生物技术领域国际标准的专门技术委员会，成立于2013年，秘书处设于德国标准化协会（DIN）。该技术委员会的工作范围涵盖生物技术研究、产品开发和应用过程中的术语、分析方法、生物加工、数据处理以及产品质量和安全要求等方面，是当前全球生物技术标准化领域最具权威性和影响力的国际标准化组织之一。ISO/TC276下设多个工作组（WorkingGroup,WG），各工作组分别负责不同技术方向的标准化工作。其中，WG3负责生物技术分析方法相关的标准研制，大规模并行测序系列标准即在该工作组的主导下推进。来自中国、美国、德国、英国、法国、日本、韩国等成员国的标准化专家深度参与了ISO20397-2:2021的起草和审议工作。中国在ISO/TC276中的参与度不断提升。中国国家标准化管理委员会（SAC）是ISO的正式成员，中国检验检疫科学研究院、中国计量科学研究院、深圳华大基因研究院、中国科学院北京基因组研究所等多家国内权威机构均有专家参与ISO/TC276的相关工作。中国专家在ISO20397-2:2021的制定过程中，在测序数据质量评价指标的设置、质量评价流程的优化以及临床适用性要求等方面提出了多项具有建设性的技术意见，为标准的完善和落地实施做出了积极贡献。3.2深圳华大基因研究院深圳华大基因研究院（BGI-Research）是全球领先的生命科学研究机构之一，也是中国参与大规模并行测序国际标准制定的核心力量之一。华大基因在测序技术和生物信息分析领域深耕多年，拥有自主知识产权的测序平台和完整的测序数据分析技术体系。依托其丰富的测序实践经验和技术积累，该研究院的多位专家深度参与了ISO20397-2:2021的技术研讨和标准起草工作。华大基因研究院在标准的制定过程中重点贡献了以下几方面的技术经验：一是基于其多平台、多类型的测序数据积累，提出了测序数据质量评价关键指标的阈值设定建议；二是在测序数据质量评价的流程规范化和自动化方面提供了丰富的实践经验；三是在临床级测序数据质量要求的设定方面贡献了基础数据和技术依据。此外，该研究院还积极参与了标准相关配套技术方案的验证测试工作，为验证标准中规定的质量评价指标和评价方法的适用性和可操作性提供了重要的实验数据支撑。3.3中国检验检疫科学研究院中国检验检疫科学研究院（CAIQ）是中国国家市场监督管理总局直属的公益性科研机构，在生物技术产品检测和标准化研究领域具有深厚积累。该研究院长期参与ISO/TC276的国内技术对口工作，承担了大量的国际标准跟踪研究和国内标准转化任务。在ISO20397-2:2021制定过程中，该研究院组织国内相关领域的专家进行多次技术研讨和意见征集，系统梳理了国内测序行业对数据质量评价标准化的技术需求，将国内在测序数据质量评价方面的实践经验和技术共识有效传递至国际标准制定工作中。同时，该研究院还承担了该标准在国内转化应用的前期研究和相关配套标准的预研工作，为标准的国内落地奠定了坚实基础。四、标准应用现状与推广前景4.1标准应用的全球态势ISO20397-2:2021自发布以来，已在全球范围内产生了广泛的技术影响力。在标准发布后的三年多时间里，该标准已被多个国家和地区的标准化机构采纳为国家标准或区域标准。在测序服务领域，越来越多的第三方医学检验实验室、临床检验中心和科研服务公司将该标准作为建立测序数据质量管理体系的重要参考依据。多个国家的药品监督管理部门在审评基于大规模并行测序的体外诊断产品时，也将ISO20397-2:2021列为重要的参考技术标准。4.2我国标准化工作进展在我国，全国生物技术标准化技术委员会（SAC/TC559）负责对口的国际标准化工作。近年来，国内已开展了将ISO20397-2:2021转化为国家标准的可行性研究和立项推进工作。与此同时，中国在积极参与国际标准制定工作的同时，也在加速推进测序数据质量评价相关的国家标准和行业标准建设。2023年发布的多项基因测序相关行业标准中，已在不同程度上参考和引用了ISO20397-2:2021所确立的技术框架和质量指标。4.3标准实施的难点与对策在标准实施过程中，也存在一些需要关注的技术难点。首先，测序技术的快速迭代使得部分标准中规定的评价指标的适用性面临挑战。随着单分子测序技术、纳米孔测序技术等新一代测序平台的不断成熟，其数据特征、错误模式和评价需求与传统的边合成边测序技术存在显