骨髓干细胞产品质量控制指南（试行）

骨髓干细胞产品质量控制指南（试行）1适用范围本指南适用于人源骨髓来源的各类临床级干细胞产品（包括造血干细胞、间充质干细胞及其他定向分化骨髓干细胞产品）的全生命周期质量控制，覆盖供者筛选、样本采集、制备、检验、储存、放行、运输、临床应用及追溯全流程，供干细胞研发机构、生产企业、开展干细胞临床研究与应用的医疗机构参照执行，不作为行政审批的强制依据，相关要求与国家法规、标准冲突时以最新生效的法规、标准为准。2术语和定义2.1骨髓干细胞产品：指从人体骨髓组织中分离获得的干细胞，经过纯化、扩增（或未经扩增）、冻存（或新鲜）制备，用于疾病预防、治疗的生物制品，不含经过基因修饰的骨髓干细胞产品。2.2供者筛查：指对提供骨髓样本的个体进行病史调查、体格检查、实验室检验，排除可能影响产品质量及受者安全的风险因素的过程，分为自体供者筛查与异体供者筛查。2.3细胞库：指经过检定合格，按照统一要求储存的细胞批次集合，分为主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）两级，主细胞库为从原始样本分离纯化获得的第一代均质细胞批次，工作细胞库为从主细胞库扩增获得的用于制备终产品的细胞批次。2.4放行检验：指骨髓干细胞产品临床使用前开展的快速质量验证，确认产品符合临床使用要求的检验流程。2.5偏差：指任何偏离已建立的操作规程、质量标准、工艺参数的情况，分为轻微偏差（不影响产品质量）、重大偏差（可能或已经影响产品质量）两类。3质量控制基本要求3.1人员要求3.1.1骨髓干细胞制备、检验、管理人员应具备生物医学、药学等相关专业大专及以上学历，其中核心技术人员应具备3年以上细胞生物相关工作经验，检验人员应持有临床检验资质证书，所有人员上岗前需经过不少于40学时的专项培训，考核合格后方可上岗，每年开展不少于20学时的继续教育与复训。3.1.2直接接触细胞的人员每年至少开展1次健康体检，排除活动性传染病、皮肤破损感染等情况，患有乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等血源性传染病的人员不得从事样本处理、制备、检验相关工作。3.1.3操作过程中人员需穿戴符合洁净级别要求的无菌服、手套、口罩、护目镜，不得佩戴首饰、化妆，操作前后严格执行手卫生规范，生物安全柜内操作时严禁跨越无菌区。3.2环境要求3.2.1骨髓干细胞制备车间应符合《药品生产质量管理规范（GMP）》要求，样本处理、分离纯化、培养扩增、冻存制备等核心操作区应达到B级背景下A级洁净度标准，检验区、物料储存区应达到C级洁净度标准，不同功能区物理隔离，避免交叉污染。3.2.2洁净度指标需符合以下要求：A级区尘埃粒子≥0.5μm的计数≤3520个/m³、≥5μm的计数≤20个/m³，沉降菌（φ90mm培养皿，暴露4h）≤1cfu/皿，浮游菌≤1cfu/m³，接触碟表面微生物≤1cfu/碟；B级区尘埃粒子≥0.5μm的计数≤352000个/m³、≥5μm的计数≤2900个/m³，沉降菌≤10cfu/皿，浮游菌≤10cfu/m³。3.2.3每批次生产前、生产后需对操作区进行消毒，采用75%医用酒精或0.2%新洁尔灭交替擦拭，避免耐药菌产生，每周开展1次全环境微生物监测，每月开展1次洁净度全项检测，检测结果不符合要求时需停止生产，开展偏差调查，整改合格后方可恢复生产。3.3物料要求3.3.1所有直接接触细胞的试剂、耗材应为临床级，优先选用无血清、无异种源成分的物料，若使用含血清、动物源成分的试剂，需提供外源因子（包括疯牛病病毒、非洲猪瘟病毒等）检测合格证明，内毒素含量≤0.25EU/mL，无支原体、微生物污染。3.3.2一次性耗材应为无菌、无热原产品，具备合格证明，不得重复使用，进口试剂、耗材需提供海关入关检验检疫报告，所有物料建立入库验收、领用台账，按照说明书要求储存，过期、不合格物料需隔离存放，统一销毁。3.3.3细胞冻存液优先选用无DMSO配方，若使用含DMSO的冻存液，DMSO终浓度不得超过5%，需提前开展毒性验证，确认对细胞活性、功能无显著影响。3.4风险管理要求建立全流程风险评估体系，每年至少开展1次全流程风险识别，针对供者漏检、样本混淆、制备污染、检验假阴性、储存温度异常等核心风险点制定防控措施，风险等级划分为高、中、低三级，高风险点需配置双重防控措施，比如样本标识采用人工核对+扫码核对双重验证，温度监测采用本地报警+远程报警双重预警。4供者与样本采集质量控制4.1供者筛选4.1.1自体供者需符合以下要求：①血清学检测HIV-1/2抗体、HBsAg、抗-HCV、抗-TP、CMV-IgM、EBV-IgM均为阴性，核酸检测HIV、HBV、HCV、CMV、EBV均为阴性；②近3个月无输血史、器官移植史、免疫抑制剂使用史；③无未控制的全身感染、髓系恶性肿瘤病史；④采集前1周未服用阿司匹林、华法林等抗凝药物，血常规、凝血功能检测正常。4.1.2异体供者除符合自体供者所有要求外，还需符合以下要求：①年龄18-55周岁，体重≥50kg，无遗传性血液病（地中海贫血、镰刀型贫血等）家族史及病史；②HLA配型与受者匹配符合临床要求，高分辨配型位点相合率≥8/10；③无精神疾病史、药物滥用史、吸毒史，肝肾功能、心电图检测正常；④育龄期女性需排除妊娠。4.2样本采集控制4.2.1采集操作需在无菌手术室或符合要求的操作室开展，采集部位为髂后上棘，严格执行无菌操作，局部麻醉采用2%利多卡因，抗凝剂选用肝素钠，终浓度控制在20-50U/mL，避免凝血。4.2.2采集量根据产品类型确定：造血干细胞移植用骨髓采集量为10-15mL/kg受者体重，终产品有核细胞数≥2×10^8个/kg受者体重；间充质干细胞制备用骨髓采集量为50-100mL，有核细胞数≥1×10^8个。4.2.3采集后的样本粘贴唯一识别条码，条码包含供者ID、采集时间、采集量、抗凝剂类型、采集人员信息，采集后1小时内开展样本初检，有核细胞活率≥90%、无明显凝血、溶血（溶血率≤5%）为合格，活率低于85%、溶血率超过10%的样本直接拒收。4.3样本转运控制采集后样本需在2小时内转运至制备车间，转运温度控制在2-8℃，采用医用保温箱存放，避免剧烈晃动、冷冻，随箱放置温度记录仪，全程记录温度，温度不符合要求的样本不得进入制备流程。5制备过程质量控制5.1分离纯化控制骨髓样本分离采用密度梯度离心法，离心参数固定为1500-2000rpm，离心15-20min，温度控制在20-25℃，离心后小心吸取单个核细胞层，避免吸入红细胞、粒细胞层，分离后采用生理盐水洗涤2-3次，有核细胞回收率≥70%、活率≥85%为合格，回收率低于60%的批次启动偏差调查。5.2培养扩增控制5.2.1细胞培养采用无血清专用培养基，间充质干细胞培养每3天换液1次，细胞汇合度达到80%-90%时传代，传代比例控制在1:2-1:4，培养代次不得超过P5代；造血干细胞扩增采用无血清造血干细胞培养基，添加细胞因子组合（SCF、Flt3-L、TPO等），扩增周期不得超过14天，避免细胞分化。5.2.2培养过程每日采用倒置显微镜观察细胞形态，间充质干细胞需呈现成纤维样贴壁生长，造血干细胞需呈现圆形悬浮集落生长，出现杂细胞、异常形态细胞的批次需废弃。5.2.3每批次制备过程设置空白对照，取同批次培养基、培养瓶，不接种细胞，与制备批次同步培养，培养结束后对照样品无菌、支原体检测为阴性，排除试剂、耗材污染。5.3冻存与细胞库管理5.3.1细胞冻存采用程序降温法，降温程序为4℃放置30min，-20℃放置1h，-80℃放置12-16h，随后转移至液氮气相储存，冻存细胞密度控制在1×10^6-1×10^7个/mL，冻存后24h取样复苏检测，细胞活率≥80%为合格，低于80%的批次不得入库。5.3.2细胞库实行两级管理，主细胞库（MCB）需开展全项质量检定，每批次分≥20个容器储存，工作细胞库（WCB）从MCB扩增获得，每批次代次差不超过2代，MCB、WCB分别存放于不同液氮罐，标识清晰，避免混淆。5.3.3细胞库建立完整台账，记录批次号、供者信息、制备日期、代次、细胞数量、检验状态、储存位置、出入库记录，所有信息可追溯。6质量检验要求所有检验方法需经过验证，精密度、准确度、专属性符合要求，检验记录保存期限不少于30年，超过产品有效期后至少保存10年。6.1入库检验细胞制备完成冻存前需开展全项入库检验，检验项目及合格标准如下：6.1.1身份鉴别：采用STR基因分型检测，与供者样本一致性为100%，排除样本混淆。6.1.2细胞质量检测：①活率：台盼蓝染色法或流式细胞术检测，造血干细胞活率≥85%，间充质干细胞活率≥90%；②细胞计数：造血干细胞有核细胞数≥2×10^8个/kg受者，CD34+细胞占比≥0.5%或≥1×10^6个/kg受者；间充质干细胞表面标志物符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准：CD73、CD90、CD105阳性率≥95%，CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR阳性率≤2%；③分化潜能：间充质干细胞成骨诱导21天茜素红染色阳性，成脂诱导14天油红O染色阳性，成软骨诱导21天阿利新蓝染色阳性。6.1.3安全性检测：①无菌检测：按照《中国药典》三部无菌检查法，需氧菌、厌氧菌、真菌培养14天，结果均为阴性；②支原体检测：培养法或荧光定量PCR法（灵敏度≥10CFU/mL）检测，结果阴性；③内毒素检测：鲎试剂法检测，含量≤0.5EU/mL；④外源因子检测：荧光定量PCR法检测HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV、EBV，结果均为阴性；⑤核型分析：G显带法分析至少20个中期分裂相，染色体数目、结构正常，无克隆性畸变；⑥残留检测：牛血清残留≤10ng/mL（若使用牛血清），DMSO残留≤0.1%，抗生素残留≤0.1μg/mL，feeder细胞残留阴性（若使用feeder层培养）。6.2放行检验临床使用前需开展放行检验，检验项目及合格标准如下：①外观：细胞悬液无浑浊、无沉淀、无絮状物，颜色均一，无异物；②pH值：7.0-7.4；③细胞活率：复苏后1小时内检测，活率≥80%；④快速无菌检测：采用微生物快速检测系统检测，2小时内结果阴性；⑤内毒素检测：含量≤0.5EU/mL。所有项目合格后由质量负责人签字放行，不合格产品不得用于临床。6.3定期抽检储存的细胞批次每半年开展1次抽检，抽检项目包括细胞活率、无菌、支原体检测，活率≥75%（储存超过1年的批次活率≥70%）、微生物检测阴性为合格；储存超过5年的批次每年开展1次全项检定，不合格批次需隔离报废，通知相关供者/受者。7储存与运输质量控制7.1储存控制细胞产品采用液氮气相储存，温度≤-150℃，配备24小时实时温度监测系统，每1小时记录1次温度，设置温度低于-140℃、液氮液位低于储罐容积1/3时的本地+远程双重报警，每3天人工核对1次液氮液位，每个批次的细胞单独存放，标识清晰标注批次号、供者信息、制备日期、代次、数量、检验状态（合格/待检/不合格），不合格批次隔离存放，避免混淆。7.2运输控制7.2.1新鲜细胞产品运输采用2-8℃医用保温箱，放置温度记录仪，运输时间不超过24小时，运输前后细胞活率下降不超过10%，温度异常超过30分钟的批次不得使用。7.2.2冻存细胞产品运输采用干冰保温箱，干冰填充量满足运输期间温度保持在-70℃以下，运输时间不超过72小时，到达后立即转移至液氮或-80℃冰箱储存，干冰完全挥发、温度高于-50℃的批次不得使用。7.2.3运输时随货附带放行单、检验报告、交接记录，交接双方核对产品信息、温度记录无误后签字确认，所有运输记录留存归档。8临床应用追溯与不良事件处理8.1追溯体系每个骨髓干细胞产品赋予唯一追溯码，覆盖供者、采集、制备、检验、储存、运输、临床使用全流程，所有环节的记录、数据关联至追溯码，实现全链条可追溯，追溯系统接入省级以上干细胞监管平台，接受监管部门核查。8.2不良事件处理8.2.1临床使用过程中出现发热、过敏、感染、器官损伤、肿瘤等疑似与产品相关的不良事件时，立即停止使用，留存剩余产品、输注器具，24小时内上报属地卫生健康部门、药品监管部门。8.2.2不良事件分为三级：轻度（一过性症状，无需特殊处理，24小时内自行缓解）、中度（需要药物或临床干预，未造成永久损伤）、重度（造成永久损伤、危及生命或死亡），接到不良事件报告后72小时内完成溯源调查，明确事件原因，若确认是产品质量问题，立即召回同批次所有产品，通知所有使用单位，对相关受者开展长期随访。8.2.3每季度汇总分析不良事件数据，针对共性问题制定纠正预防措施，更新操作规程、质量标准。9偏差管理与持续改进9.1所有偏离操作规程、质量标准、