药品分析方法验证指南(试行)

药品分析方法验证指南(试行)1目的与适用范围为规范药品研发、生产、注册申报及上市后变更过程中分析方法的验证工作，保证分析结果准确、可靠、可重现，保障药品质量可控，制定本指南。本指南为药品分析方法验证的通用技术要求，适用于各类药品（化学药、中药、生物制品）质量控制中定性、定量分析方法的验证，涵盖鉴别试验、杂质检查、含量测定、溶出度/释放度检查、含量均匀度检查、微生物限度检查、生物活性测定等各类分析方法，也适用于新药研发、仿制药开发、上市后质量标准变更等不同场景下的方法验证工作。特殊管理药品、特殊剂型（如放射性药品、细胞治疗产品）可在本指南基础上，结合品种特点调整验证项目与接受标准。2术语与定义2.1分析方法验证：通过设计合理的实验室试验，证明拟定分析方法的性能能够符合预期分析目的与质量控制要求，可稳定获得准确可靠结果的过程。2.2专属性：在存在其他潜在干扰组分（辅料、杂质、降解产物、基质组分等）时，分析方法能够准确特异地识别或测定被测物的能力。2.3准确度：测定结果与真实值或公认参考值的接近程度，通常用回收率表示。2.4精密度：在相同测定条件下，对同一均匀供试品进行多次独立测定，所得结果之间的一致性程度，分为重复性、中间精密度、重现性三类：①重复性：相同操作条件、短时间内，同一分析人员、同一仪器获得的精密度；②中间精密度：同一实验室内，不同日期、不同分析人员、不同仪器获得的精密度，反映实验室内部方法的日间变异；③重现性：不同实验室之间获得的精密度，反映方法的空间重现性。2.5检测限（LOD）：供试品中被测物能够被可靠检出的最低浓度或量，仅要求定性判断，不需要准确定量。2.6定量限（LOQ）：供试品中被测物能够以可接受的准确度和精密度定量测定的最低浓度或量。2.7线性：在方法规定范围内，分析方法的响应值与被测物浓度之间呈正比例关系的程度。2.8范围：分析方法能够满足准确度、精密度、线性要求的被测物浓度区间，与分析目的直接相关。2.9耐用性：分析方法测定条件发生微小合理变动时，测定结果不受影响的承受程度，反映方法的耐受性。3验证工作基本流程3.1明确分析目的与方法类型：根据分析方法的用途（定性鉴别、限度检查、定量测定等）确定需要验证的项目与接受标准，不同用途的方法验证要求不同。3.2制定验证方案：验证方案需经批准后实施，内容至少包括：分析方法背景与来源、分析目的、验证项目、试验设计、每个项目的接受标准、人员分工、时间安排、记录要求。3.3实施验证试验：严格按照方案开展试验，完整记录所有原始数据、仪器参数、环境条件，所有试验需可重复、可追溯。3.4结果评价与偏差处理：对每个试验结果进行统计分析，对比接受标准判定是否符合要求，对偏差进行调查处理。3.5出具验证验证完成后形成验证报告，明确验证结论，判定方法是否符合要求，可否用于实际质量控制。4核心验证项目与技术要求4.1专属性专属性是所有分析方法均需验证的核心项目，不同类型方法的验证要求如下：（1）鉴别试验：需证明方法能够特异性区分目标物与结构相似化合物、相关杂质、空白辅料。试验设计：分别制备目标物阳性样品、不含目标物的空白样品（仅含辅料和共存杂质）、结构相似物样品，依法测定，要求：阳性样品呈阳性结果，阴性样品和结构相似非目标物样品呈阴性结果，无假阳性、假阴性。（2）色谱法用于杂质检查与含量测定：需考察主成分与杂质、杂质与杂质之间的分离度，同时通过强制降解试验考察降解产物的分离情况。强制降解试验一般考察酸、碱、氧化、高温、光照五种条件：酸降解采用0.1mol/L~1mol/L盐酸，碱降解采用0.1mol/L~1mol/L氢氧化钠，氧化降解采用3%~30%过氧化氢，高温降解采用60℃~100℃放置，光照降解控制总照度不低于1.2×10^6lx·h；主成分降解率一般控制在5%~20%，对于极不稳定药品降解率超过20%也可接受，只要分离度符合要求即可。接受标准：主成分峰与所有杂质峰、降解产物峰的分离度≥1.5，各杂质之间分离度≥1.5；采用二极管阵列检测器检测时，主成分峰纯度因子≥990，证明主峰不含共流出杂质；空白辅料、溶剂的峰不干扰目标峰的测定，空白峰位置不覆盖目标峰。（3）生物分析方法：需考察基质效应，要求内标归一化的基质因子在85%~115%之间，基质因子的RSD≤15%，无明显基质干扰。专属性接受标准：所有干扰不影响目标物的测定，即为符合要求。4.2准确度所有定量分析方法均需验证准确度，一般采用加样回收法测定：在空白基质（辅料、溶剂）中加入已知量的被测物对照品，配制成不同浓度的样品，依法测定，计算回收率，回收率=（测得量/加入量）×100%。试验设计一般采用3浓度水平、每个水平3份平行样，共9份样品，特殊情况可采用100%浓度6份平行样。接受标准根据被测物含量水平设定，具体如下：（1）主成分含量测定（含量范围90%~110%）：平均回收率要求为98.0%~102.0%，回收率的RSD≤2.0%；（2）含量在1%~10%之间的组分：平均回收率要求95.0%~105.0%，RSD≤3.0%；（3）含量在0.1%~1%之间的杂质：平均回收率要求85.0%~115.0%，RSD≤10.0%；（4）含量低于0.1%的杂质：平均回收率要求80.0%~120.0%，RSD≤20.0%；（5）基因毒性杂质等痕量组分：含量在ppm级别，平均回收率要求70.0%~130.0%，RSD≤20%即可；（6）容量法、重量法等经典方法：要求测定结果与理论值的偏差不超过±0.5%。4.3精密度所有定量分析方法均需验证精密度，分为三个层级验证：4.3.1重复性：试验设计同准确度，可采用3浓度9份样品或100%浓度6次测定，接受标准：主成分含量测定RSD≤2.0%；1%以上杂质RSD≤5.0%；0.1%~1%杂质RSD≤10.0%；低于0.1%杂质RSD≤20.0%。4.3.2中间精密度：考察同一实验室不同影响因素（不同日期、不同人员、不同仪器）的变异，要求至少变动两个因素，如不同日期+不同人员，不同日期+不同仪器，采用相同的样品进行测定，计算所有测定结果的RSD。接受标准：主成分RSD≤3.0%；1%以上杂质RSD≤8.0%；0.1%~1%杂质RSD≤15.0%；低于0.1%杂质RSD≤25.0%。4.3.3重现性：要求法定方法、多实验室共用方法、仿制药关键质量属性的分析方法需做，由至少两个不同实验室共同完成试验，计算不同实验室测定结果的RSD。接受标准：主成分RSD≤4.0%，杂质RSD不超过中间精密度接受标准的1.5倍。特殊项目精密度要求：溶出度测定精密度RSD≤5.0%，含量均匀度测定RSD≤3.0%。4.4检测限仅用于杂质限度检查，常用测定方法为两种：①信噪比法：逐步稀释被测物溶液，测定信噪比，以信噪比S/N=3:1时的浓度为检测限；②标准偏差法：通过测定空白基质的响应偏差，计算LOD=3.3δ/S，其中δ为空白响应的标准偏差，S为线性曲线的斜率。接受标准：检测限≤杂质限度的30%，保证低于限度的杂质能够被可靠检出，避免漏检。4.5定量限仅用于杂质定量测定，测定方法同检测限，信噪比法以S/N=10:1时的浓度为定量限，公式法LOQ=10δ/S。接受标准：定量限≤杂质限度的50%，且定量限浓度样品测定的回收率、精密度符合对应浓度的要求，保证杂质在限度浓度附近能够准确定量。4.6线性定量分析方法均需验证线性，试验设计要求至少制备5个浓度梯度的被测物溶液，每个浓度至少测定2次，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程、相关系数，分析残差分布。接受标准：①主成分含量测定、杂质定量测定（含量≥0.1%）：相关系数r≥0.998；②含量低于0.1%的痕量杂质：相关系数r≥0.990；③容量法：相关系数r≥0.999；④截距要求：截距的绝对值除以100%浓度的响应值≤2%，证明截距对结果的影响可忽略，若超过2%需采用多点校正曲线，不得采用单点校正。非线性方法（如酶联免疫吸附测定）不要求线性相关系数，需采用合适的模型拟合，拟合度符合要求即可。4.7范围范围是满足方法性能要求的浓度区间，需覆盖实际样品中被测物的可能波动范围，不同用途方法的范围要求：①主成分含量测定：范围为测试浓度的80%~120%；②含量均匀度检查：范围为标示量的70%~130%；③溶出度测定：范围为标示量的50%~120%，缓释/控释制剂释放度测定范围为标示量的10%~150%；④杂质定量检查：范围为定量限到杂质限度的120%，毒性杂质范围为定量限到杂质限度的150%；⑤杂质限度检查：范围为检测限到杂质限度的120%。4.8耐用性所有分析方法均需验证耐用性，考察测定条件发生微小变动时结果的稳定性，常见考察因素：①色谱法：流动相比例±5%、流动相pH±0.2、不同品牌色谱柱（至少3个品牌）、柱温±5℃、流速±0.2mL/min、检测波长±5nm；②溶出度测定：转篮转速±5rpm、桨法转速±2rpm、溶出介质pH±0.1、脱气程度差异；③容量法：反应温度±5℃、指示剂用量±0.5倍、滴定终点判断差异。试验设计：每次变动一个因素，测定样品结果，与原条件下的结果比较。接受标准：变动条件下，主成分回收率在97.0%~103.0%之间，杂质回收率符合对应浓度要求，色谱分离度仍≥1.5，所有测定结果的RSD≤2.0%，即为耐用性良好。若某一因素变动后结果不符合要求，需在分析方法中明确该条件的允许范围，限定操作要求，保证结果稳定。5不同类型分析方法的验证项目要求不同分析方法根据用途，所需验证的项目不同，具体要求如下：（1）鉴别试验：必做项目为专属性、耐用性，无需做准确度、精密度、线性、范围；（2）杂质限度检查：必做项目为专属性、检测限、耐用性；（3）杂质定量检查：必做项目为专属性、准确度、精密度（重复性、中间精密度）、定量限、线性、范围、耐用性；（4）主成分含量测定：必做项目为专属性、准确度、精密度（重复性、中间精密度）、线性、范围、耐用性；（5）溶出度/释放度测定：必做项目同主成分含量测定，额外增加转速、溶出介质参数的耐用性考察；（6）含量均匀度测定：同主成分含量测定，范围需覆盖标示量的70%~130%；（7）微生物限度/无菌检查：必做项目为专属性（抑菌活性考察）、准确度、精密度、耐用性；（8）生物活性测定：必做项目为专属性、准确度、精密度（重复性、中间精密度、重现性）、线性、范围、耐用性。6验证结果判定与偏差处理6.1结果判定：所有验证项目均符合预先拟定的接受标准，方可判定分析方法验证通过，可用于药品质量控制；若有任何一个核心项目不符合要求，不得判定通过。6.2偏差处理：出现结果偏差时，首先调查偏差原因，若偏差为操作失误、仪器临时故障、供试品配制错误等偶然因素导致，可重新开展该项目试验，重新试验结果符合要求即可判定通过；若偏差为方法本身设计缺陷导致，需调整方法参数后，重新开展所有相关项目的验证；若仅耐用性某一因素不符合要求，可通过在方法中明确限定该因素的控制范围，无需重新全验证，即可判定符合要求。7验证文档管理验证工作需保留完整文档，具体要求：①验证前需有正式批准的验证方案，明确所有验证要求；②验证过程保留完整原始记录，包括所有原始数据、谱图、仪器打印结果、操作记录，原始记录需可追溯；③验证完成后出具正式验证报告，内容包括验证方案摘要、所有项目结果汇总、结果对比、验证结论，由验证人员、审核人员签字批准；④所有验证文档按照药品注册与药品生产质量管理规范要求归档保存，上市药品验证文档至少保存至药品有效期后1年，注册申报的验证文档永久保存。8特殊场景的验证要求8.1采用中国药典、欧洲药典等法定公开收载的方法，首次使用时仅需验证专属性、系统适用性、