ISO 71022024 婴儿配方奶粉β-低聚半乳糖的测定柱前衍生化荧光检测超高效液相色谱法标准立项发展报告

婴儿配方奶粉β-低聚半乳糖的测定柱前衍生化荧光检测超高效液相色谱法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:InfantFormula—Determinationofβ-galactooligosaccharides—UltraHighPerformanceLiquidChromatography(UHPLC)withFluorescenceDetectionafterPre-columnDerivatization摘要随着全球婴幼儿营养科学和食品工业的迅猛发展，母乳化配方奶粉的研究与生产已成为食品科技领域的重要方向。β-低聚半乳糖（β-Galactooligosaccharides,β-GOS）作为母乳中天然存在的重要益生元成分，其在婴儿配方奶粉中的应用日益广泛，对婴幼儿肠道微生态的建立和免疫系统的发育具有关键的生理功能。然而，由于β-GOS结构复杂、同分异构体众多，且配方奶粉基质的干扰严重，其准确定量一直是国际食品分析领域的难点问题。为应对这一技术挑战，国际标准化组织（ISO）于2024年8月12日正式发布了ISO7102:2024标准，确立了基于柱前衍生化结合荧光检测的超高效液相色谱法（UHPLC-FLD）作为β-GOS的权威测定方法。本标准首次在国际层面系统规定了从样品前处理、衍生化反应、色谱分离到定量计算的全流程技术规范，有效解决了长期以来不同实验室间检测结果可比性差的难题。本报告全面梳理了该标准的立项背景、编制历程、核心技术内容、试验验证情况及推广应用前景，并详细介绍了主要起草单位的工作概况，旨在为食品检验检测机构、乳品生产企业和科研院校提供系统的技术参考与实施指导。该标准的发布填补了国际低聚半乳糖检测方法标准的空白，对提升全球婴幼儿配方食品质量安全水平具有里程碑式的意义。关键词：β-低聚半乳糖；婴儿配方奶粉；超高效液相色谱法；柱前衍生化；荧光检测；国际标准；食品安全检测Keywords:β-galactooligosaccharides;Infantformula;Ultrahighperformanceliquidchromatography(UHPLC);Pre-columnderivatization;Fluorescencedetection;Internationalstandard;Foodsafetyanalysis1引言1.1研究背景母乳是婴幼儿最理想的营养来源，其中所含的母乳低聚糖（HumanMilkOligosaccharides,HMOs）在数量上位居母乳固形物成分的第三位，发挥着调节肠道菌群、抗病原微生物黏附、调节免疫应答等多种重要生物学功能。然而，天然母乳低聚糖的来源极为有限，难以实现大规模商业化生产。β-低聚半乳糖作为一种以乳糖为底物、经β-半乳糖苷酶催化转糖苷反应而制成的新型益生元，其结构单元和糖苷键类型与母乳中部分低聚糖具有高度相似性，是目前公认的母乳低聚糖最理想的替代成分之一。近年来，随着对β-GOS生理功能研究的不断深入，全球各大婴幼儿配方奶粉生产商已将β-GOS作为核心功能配料广泛添加至产品中。据统计，目前全球添加β-GOS的婴幼儿配方奶粉产品已超过500种，覆盖欧洲、北美、亚太等主要市场。中国作为全球最大的婴幼儿配方奶粉消费国，相关添加β-GOS的产品市场占有率亦逐年攀升。然而，与β-GOS在市场上的广泛应用形成鲜明对比的是，其检测技术发展相对滞后。β-GOS的化学结构十分复杂，通常由2-10个糖单元通过β-1,4、β-1,3、β-1,6等不同糖苷键连接而成，每一聚合度均存在多种位置异构和立体异构体。实际商业产品中，β-GOS的组成可包含数十种甚至上百种不同的寡糖分子。加之配方奶粉基质中含有大量蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质等干扰组分，以及配方中可能同时添加低聚果糖（FOS）、聚葡萄糖等其他益生元成分，这些因素共同构成了β-GOS准确定量的巨大技术障碍。1.2标准立项的必要性在ISO7102:2024发布之前，β-GOS的检测在国际范围内尚未形成统一的标准化方法。不同实验室和生产企业采用的方法各异，主要包括高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）、高效液相色谱-示差折光检测法（HPLC-RID）、离子色谱-脉冲安培检测法（IC-PAD）以及质谱联用技术等。这些方法在灵敏度、选择性、分辨率和操作便捷性等方面各有利弊，但均存在不同程度的局限：-HPLC-RID法灵敏度较低，对痕量β-GOS的检测能力有限，且无法进行梯度洗脱，难以实现复杂低聚糖混合物的有效分离；-HPLC-ELSD法虽然兼容梯度洗脱，但其响应与待测物质量呈非线性关系，定量准确性受限；-IC-PAD法对寡糖具有良好的分离效果，但设备成本高昂，操作要求高，且对高盐浓度流动相的兼容性差，普及性不足；-质谱联用技术虽然灵敏度和选择性最优，但仪器投入大，对操作人员技术能力要求高，难以在普通检验检测机构中广泛推广。上述方法的多样性导致了不同实验室间检测结果存在显著差异，严重制约了国际间产品质量的可比性和监管的有效性。根据国际食品法典委员会（CAC）关于婴儿配方食品中益生元成分声明和标签的指导原则，必须建立国际上统一的、经过充分验证的可靠检测方法，才能为法规执行和贸易仲裁提供科学依据。1.3标准编制过程ISO7102:2024的制定工作经历了严谨而科学的国际化流程，由国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34）下设的食品试验和分析一般方法分技术委员会（ISO/TC34/SC9）归口管理。该标准的制定工作于2019年正式启动，由丹麦标准化机构（DS）承担秘书处工作，来自中国、美国、德国、法国、荷兰、日本、新西兰等20余个国家的专家共同参与了起草和审定工作。标准的制定遵循了ISO导则所规定的规范性程序，包括预备工作项目（PWI）阶段、新工作项目提案（NP）阶段、工作组草案（WD）阶段、委员会草案（CD）阶段、国际标准草案（DIS）阶段、最终国际标准草案（FDIS）阶段等若干关键节点。草案历经多轮技术讨论和实验室间协同验证，收到了来自各成员国和联络组织的数百条技术意见，并逐一予以研究处理。经过项目组和国际专家的持续努力，标准最终于2024年4月进入FDIS投票阶段，并以高赞成率获得通过，于2024年8月12日正式出版发布。2标准主要内容2.1标准适用范围ISO7102:2024标准适用于婴儿配方奶粉中β-低聚半乳糖含量的测定。标准所规定的检测方法可覆盖市售婴幼儿配方奶粉产品中β-GOS含量在0.5g/100g至10g/100g（以产品计）的定量分析范围，满足国际食品法典委员会对配方奶粉中添加益生元的标签声称要求。此外，该标准还可延伸适用于较大婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉以及特殊医学用途婴儿配方食品等同类基质的检测，具有较好的适用性和推广潜力。2.2方法原理该方法的核心原理是：试样经水溶解后，采用乙腈沉淀蛋白和脂肪，离心取上清液，利用固相萃取（SPE）小柱对样品进行净化以去除残留的蛋白质、盐类及其他干扰物质。净化后的样品在酸性条件下与具有荧光特性的衍生化试剂（如2-氨基苯甲酰胺，2-AB）发生还原胺化反应，使β-GOS分子上标记上荧光发色团。衍生化产物经超高效液相色谱系统分离，采用亲水相互作用色谱（HILIC）柱或氨基柱进行梯度洗脱，各β-GOS组分在色谱柱上根据分子大小和结构差异得到有效分离。最后，经荧光检测器在激发波长λex=330nm、发射波长λem=420nm条件下进行检测，外标法定量。2.3关键技术要素2.3.1样品前处理标准详细规定了样品前处理的具体操作步骤和条件参数。对于婴儿配方奶粉试样，准确称取适量样品（精确至0.1mg），用预热至50℃的纯水溶解并定容，充分混匀。移取适量样液，加入乙腈沉淀蛋白，于4℃下静置离心。取上清液过SPE固相萃取小柱净化，收集洗脱液，氮吹浓缩至近干，待衍生化处理。标准对SPE小柱的填料类型、规格、活化条件、上样量、淋洗液种类和洗脱体积均给出了明确的规定，以保证不同实验室间前处理条件的一致性。2.3.2衍生化反应标准将柱前衍生化的反应条件作为方法的核心关键点加以严格规定。衍生化试剂采用2-氨基苯甲酰胺（2-AB），其与还原糖的醛基在还原剂（2-甲基吡啶硼烷或氰基硼氢化钠）存在下发生还原胺化反应，生成稳定的荧光标记衍生物。标准明确了衍生化反应的试剂浓度、反应温度（65℃±1℃）、反应时间（2h）、催化剂用量以及反应终止方式等关键参数。通过对衍生化产物的稳定性进行系统考察，证实衍生化后的样品在4℃下避光保存可稳定至少7天，确保了检测工作的时效性和重现性。2.3.3色谱分离条件标准推荐采用超高效液相色谱系统，配备亲水相互作用色谱柱（如ACQUITYUPLCBEHAmide柱，2.1mm×100mm，1.7μm粒径，或等效柱），柱温控制在60℃±1℃。流动相A为含0.1%甲酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1%甲酸的甲酸铵水溶液，采用梯度洗脱程序，流速为0.4mL/min。系统适应性要求中规定，色谱柱塔板数不低于10000，相邻色谱峰的分离度不低于1.5，各组分色谱峰面积的相对标准偏差不超过5%。2.3.4定量方法关于定量策略，标准采用了总β-GOS定量的思路。由于市售β-GOS产品是由不同聚合度和不同糖苷键连接方式构成的复杂混合物，标准规定以待测样品所用的β-GOS商品原料作为标准对照物质进行外标定量。具体而言，选择与样品标签声称所用相同来源的β-GOS原料（以干基计纯度≥90%），经过与样品完全相同的衍生化处理，以系列浓度制作标准曲线。比较样品和标准品在相同保留时间窗口内的总色谱峰面积（扣除空白），从而计算样品中β-GOS的总含量。这一方法策略充分考虑了β-GOS组成随原料来源和酶解条件不同而变化的客观事实，兼顾了方法的普适性和定量的准确性。2.4方法性能指标经过国际多实验室协同验证（collaborativestudy），本方法的性能指标如下：-检出限（LOD）：0.05g/100g（以产品计）-定量限（LOQ）：0.15g/100g（以产品计）-重复性限（r）：0.12g/100g-再现性限（R）：0.30g/100g-回收率范围：在添加水平为1g/100g、5g/100g和10g/100g时，平均回收率介于92.5%~105.3%之间-相对标准偏差（RSDr）：2.1%~4.8%（重复性条件）-相对标准偏差（RSDR）：3.6%~7.2%（再现性条件）上述结果表明，该方法在灵敏度、准确度和精密度方面均达到了国际食品分析化学领域对微量功能成分定量分析的严格要求（以HorRat值评估为0.4~1.1），具备国际标准方法应有的可靠性。3标准的技术先进性与创新点ISO7102:2024相对于此前国内外已发布的相关方法和标准，在以下方面实现了技术突破和创新：第一，首次将超高效液相色谱（UHPLC）技术引入β-GOS的国际标准测定中。与常规高效液相色谱（HPLC）相比，UHPLC采用亚2μm粒径的色谱柱填料，在显著提高分离效率的同时大幅缩短分析时间。单个样品的色谱分析时间从传统方法的40~60分钟缩短至20分钟以内，有机溶剂消耗量降低了70%以上，体现了绿色分析化学的理念。第二，采用荧光检测器替代了传统蒸发光散射或示差折光检测器，检测灵敏度提升了1~2个数量级。荧光检测具有选择性好、信噪比高、基线平稳等突出优点，可有效克服梯度洗脱过程中基线漂移对定量准确性的不利影响。第三，标准化了β-GOS商品原料作为定量参照物的技术路线。该方法策略在国际标准层面上首次得到规范化表述，有效解决了由于缺乏纯品标准物质而导致的定量准确性问题。第四，标准中包含了对不同聚合度β-GOS组分的指纹图谱信息。标准附录中推荐各实验室建立β-GOS标准品的色谱指纹图谱，并以此作为批间一致性和产品质量稳定性评估的辅助手段。这一创新性安排为生产企业的质量控制提供了额外的技术工具。4主要起草单位介绍ISO7102:2024的制定汇聚了国际食品分析领域众多权威机构和知名专家的智慧和力量。其中，来自丹麦的ArlaFoodsamba公司在标准的制定过程中发挥了关键作用。ArlaFoodsamba公司成立于1881年，总部位于丹麦维比，是欧洲历史最悠久、规模最大的乳制品合作企业之一，业务遍及全球100多个国家和地区。该公司由来自丹麦、瑞典、英国、德国、比利时、卢森堡和荷兰的农民共同所有，是全球最大的有机乳制品生产商，也是全球领先的婴幼儿配方奶粉供应商之一。在β-GOS研究和标准化方面，ArlaFoodsamba公司具有深厚的技术积累。该公司自2000年代初即在丹麦Aarhus设立专门的乳品功能成分研发中心，配备了包括超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）、离子色谱-脉冲安培检测（IC-PAD）、亲水作用色谱-蒸发光散射检测（HILIC-ELSD）等多种高端分析仪器平台，拥有一支由食品化学、分析化学、生物化学和营养学等多学科背景研究人员组成的技术团队。在ISO7102:2024标准制定过程中，ArlaFoodsamba公司的科学家团队承担了方法预研、单实验室验证、合作实验室协同试验的组织协调以及标准文本关键章节起草等工作，为标准的顺利发布作出了不可替代的贡献。此外，该标准的主要起草工作还得到了以下机构的重要参与：丹麦国家食品研究所（DTUFood）、荷兰瓦赫宁根大学食品化学实验室、美国药典委员会（USP）食品成分专家小组以及中国检验检疫科学研究院等。这些机构在方法验证方案设计、数据统计分析以及技术审查等方面发挥了重要的专业支撑作用。5标准的应用前景5.1国际层面的应用意义ISO7102:2024作为首个关于食品基质中β-GOS检测的国际标准，其发布具有深远的国际影响。首先，为国际食品法典委员会（CAC）关于婴幼儿配方食品中益生元的法规标准制定提供了可靠的方法学基础。其次，为各国食品安全监管机构对进口婴幼儿配方奶粉中β-GOS含量声称的核查提供了统一的技术准绳，有效促进了国际贸易中的技术协调和争端解决。再次，为全球婴幼儿配方奶粉生产企业的产品质量控制和出厂检验提供了权威的技术依据。5.2国内层面的应用前景近年来，我国婴幼儿配方奶粉产业快速发展，β-GOS作为重要的功能配料已被广泛添加至各品牌产品中。我国现行的《食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品》（GB10769）和《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》（GB10767）等标准中规定了低聚半乳糖的添加限量，但配套的检测方法标准仍不完善。ISO7102:2024的发布为我国相关食品安全国家标准的制修订提供了重要的参考蓝本，有望推动我国β-GOS检测方法标准的尽快出台，为国内市场监管提供有效的技术支持。5.3未来发展方向展望未来，β-GOS检测技术的发展将呈现以下趋势：一是随着新型β-GOS产品（如特定聚合度分布的功能性产品）不断涌现，检测方法需进一步提升对不同结构组分的区分能力；二是高通量、自动化前处理技术与在线检测系统的集成将进一步减少人工操作误差、提高检测效率；三是高分辨质谱技术的普及将推动对β-GOS精细结构的深入表征，可能催生"总含量+结构分布"双重指标的新型标准方法；四是随着母乳低聚糖（HMO）工业化生产技术的成熟，ISO7102:2024所确立的分析方法学原理有望扩展应用于婴幼儿配方奶粉中HMO成分的检测标准制定。6结论ISO7102:2024《婴儿配方奶粉β-低聚半乳糖的测定柱前衍生化荧光检测超高效液相色谱法》国际标准的正式发布，是婴幼儿营养食品分析领域一项具有里程碑意义的成果。该标准凝聚了国际学术界、产